[發明專利]一種檢測血小板微粒的方法

有效

• 申請號: 201210156634.7
• 申請日: 2012-05-18
• 公開（公告）號: CN102645398A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 張彥軍;張建寧;董京飛;劉麗
• 申請（專利權）人: 天津醫科大學總醫院
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

技術領域

本發明涉及一種檢測血小板微粒的方法。

背景技術

血液細胞微粒(Microparticles,MP)是一類存在于血液中,由多種細胞(如血小板、白細胞、淋巴細胞、紅細胞、內皮細胞、血管平滑肌細胞等)受刺激活化或凋亡而脫落的超微膜性囊泡。其中，血小板微粒（Platelet?Microparticle,PMP）約占血液中MP總量的70%～90%。血小板微粒（PMP）膜上攜帶有靜息狀態下血小板膜上的多數活性成分，因此像血小板一樣具有促進止血和加速凝血的功能；此外，PMP膜也攜帶活化血小板膜上的標記物，不僅具有很強的促凝活性，也具有一定的抗凝活性，在人體血栓與止血過程中發揮重要作用，因此對PMP形成機制的研究具有重要意義。由于多數PMP的直徑小于0.5μm，常規方法的靈敏度和分辨率不夠，不能用普通顯微鏡觀察到其形態，不能用包括血小板計數儀在內的常規方法來檢測。許多早期的學者，通過測定含血小板微粒懸液中無機磷的含量，來推算磷脂的量，進而推算出血小板微粒的量。這種方法非常不準確，而且十分繁瑣。目前通用的PMP檢測方法為電鏡和流式細胞術。但電鏡需要對PMP進行固化和噴金處理以實現PMP的導電性，因此檢測樣品制備繁瑣、困難，且難以定量。流式細胞術利用PMP大小與表面抗原特性來研究PMP的形成時，一般將直徑小于0.5μm的顆粒均視為PMP，但是這一范圍內的顆粒很可能是其他血細胞碎片或雜質顆粒，因此需利用多種血小板特異性熒光抗體對PMP做進一步的識別，然而過多的熒光抗體不僅價格昂貴，而且干擾因素較多，造成PMP檢測結果出現偏差。因此很有必要建立一種靈敏、精確、定量的PMP檢測方法。

近年來SICM技術通過改進定位及掃描控制技術實現了在生理液態培養條件下實時、非接觸式地對活體生物樣品表面三維微觀結構的探測。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種先通過SICM高分辨直觀地定性研究血小板活化后血小板微粒的形成，再利用流式細胞術定量分析這些血小板微粒數量的檢測血小板微粒的方法。

本發明的技術方案概述如下：

一種檢測血小板微粒的方法，包括如下步驟：

（1）血小板樣品的制備

取2毫升靜脈血放入檸檬酸鈉抗凝管中，離心后得到富血小板血漿；取200μL所述富血小板血漿放置于涂覆有200μL濃度為2mg/mL纖維蛋白原的35mm細胞培養皿中室溫下孵育20-30分鐘，用PBS緩沖液洗脫未粘附在所述細胞培養皿底部的血小板后，加入1.5-2mLPBS緩沖液后備用；

（2）取200μL細胞培養皿中的上清液，利用流式細胞儀定量分析血小板微粒的數量；

（3）將連接在掃描離子電導顯微鏡的Ag/AgCl參比電極放置在步驟（1）獲得的細胞培養皿中；將連接在掃描離子電導顯微鏡的探測電極放置在步驟（1）獲得的細胞培養皿中，所述探測電極是一設置在充灌有PBS緩沖液的納米吸管內的Ag/AgCl電極；

（4）用掃描離子電導顯微鏡監控流入探測電極電流的變化，通過負反饋控制使得跳躍的探測電極與血小板間保持設定的距離，記錄下所述探測電極的位置，通過計算機繪制得到血小板表面形貌的三維拓撲結構圖；

（5）向細胞培養皿中加入激活劑，作用60分鐘，通過計算機繪制得到加入所述激活劑60分鐘后血小板表面形貌的三維拓撲結構圖,并定性地觀測血小板微粒的形成；

（6）取200μL加入了激活劑的細胞培養皿中的上清液，利用流式細胞儀定量分析血小板在激活后形成的血小板微粒的數量。

所述激活劑為凝血酶或ADP,所述凝血酶的加入量是使凝血酶的終濃度為2U/mL,所述ADP的加入量是使ADP的終濃度為5μM。

本發明的方法排除了其它血細胞碎片和污染顆粒對血小板微粒（PMP）檢測的影響，定性定量地檢測了PMP，無需染色及任何特殊處理，節省了血小板特異性抗體用量，提高了PMP形成檢測的準確性。

附圖說明

圖1為本發明所涉利用探針跳躍式SICM顯微鏡技術進行非接觸式、高分辨率實時檢測5μM?ADP血小板活化后三維形態變化及PMP的形成過程。（圖1A為加入ADP前SICM掃描圖；圖1B為加入ADP?60分鐘后SICM掃描圖）。

圖2為本發明所涉利用流式細胞儀得到的在加入激活劑ADP前（A）、后(B)培養皿上清液中PMP數量的變化圖。

具體實施方式

實施例1

一種檢測血小板微粒的方法，包括如下步驟：

（1）血小板樣品的制備