[發明專利]纖維素固定化順式環氧琥珀酸水解酶及制備酒石酸的方法

無效

• 申請號: 201210156272.1
• 申請日: 2012-05-21
• 公開（公告）號: CN102703419A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 崔球;王珊;崔古貞;馮銀剛
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12N11/12
• 分類號: C12N11/12;C12P7/46
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.纖維素固定化順式環氧琥珀酸水解酶的方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)在編碼順式環氧琥珀酸水解酶基因的N端或C端融合碳水化合物結合模塊CBM30，得到融合表達載體；

(2)將融合表達載體轉化到大腸桿菌中，高效可溶性表達融合蛋白，得到目標菌體；

(3)采用pH為7.4的磷酸鹽緩沖液洗滌目標菌體并重懸細胞，將重懸細胞進行破碎，離心得到粗酶液；

(4)將粗酶液與纖維素混合，離心得到沉淀，采用pH為7.4的磷酸鹽緩沖液淋洗沉淀并再次離心，所得沉淀即為目標產物固定化酶。

2.根據權利要求1所述的纖維素固定化順式環氧琥珀酸水解酶的方法，其特征在于：所述步驟(2)包括以下步驟：a.細胞培養：將大腸桿菌置于培養液中，在37℃下培養至OD600為0.8-1.0；b.誘導表達：加入IPTG至其濃度為0.2mM，25℃的溫度條件下誘導培養8小時；c.離心，收集菌體。

3.根據權利要求1所述的纖維素固定化順式環氧琥珀酸水解酶的方法，其特征在于：所述步驟(3)破碎目標菌體可以采用高壓細胞破碎、超聲破碎或者溶菌酶破碎中的任意一種。

4.根據權利要求1所述的纖維素固定化順式環氧琥珀酸水解酶的方法，其特征在于：所述步驟(3)中的離心可以在4℃的溫度條件和10000rpm的轉速下離心20min。

5.根據權利要求1所述的纖維素固定化順式環氧琥珀酸水解酶的方法，其特征在于：所述步驟(4)中所述纖維素與粗酶液中酶的質量比為1∶0.005-1∶0.02。

6.采用纖維素固定化順式環氧琥珀酸水解酶制備酒石酸的方法，其特征在于：包括以下步驟：將纖維素固定化順式環氧琥珀酸水解酶加入順式環氧琥珀酸的溶液中，在pH為5-11，溫度為25-70℃的條件下反應，即得到目標產物酒石酸。

7.根據權利要求6所述的采用纖維素固定化順式環氧琥珀酸水解酶制備酒石酸的方法，其特征在于：所述纖維素固定化順式環氧琥珀酸水解酶為D型時，所述反應體系中還含有0.1mM-10mM的Zn²⁺，所得目標產物為D型酒石酸。

8.根據權利要求7所述的采用纖維素固定化順式環氧琥珀酸水解酶制備酒石酸的方法，其特征在于：制備L型酒石酸反應的最佳反應溫度為30-50℃，最佳反應pH為8-10；制備D型酒石酸反應的最佳反應溫度為30-50℃，最佳反應pH為5-9。