[發(fā)明專利]殺線蟲晶體蛋白基因cry003-131及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210156083.4
• 申請(qǐng)日: 2012-05-18
• 公開（公告）號(hào): CN103421098A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫明;劉盈盈;葉偉星;彭東海;張爭(zhēng)名;阮麗芳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/325
• 分類號(hào): C07K14/325;C12N15/32;C12N1/21;C12N1/15;C12N1/19;A01H5/00;A01N63/02;A01P5/00;C12R1/07
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 張紅兵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物防治和農(nóng)業(yè)微生物基因工程領(lǐng)域。具體涉及一個(gè)具有殺線蟲活性的殺蟲晶體蛋白基因的分離、克隆以及其編碼的蛋白在微生物殺蟲劑和轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用。?

背景技術(shù)

蘇云金芽胞桿菌(Bacillus?thuringiensis,Bt)是一類廣泛分布于環(huán)境之中的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，在其生長(zhǎng)發(fā)育的中后期可以形成內(nèi)生芽胞，并且伴隨芽胞形成的同時(shí)，能產(chǎn)生一類對(duì)多種昆蟲具有特意毒殺活性的殺蟲晶體蛋白(Insecticidal?Crystal?Protein,ICPs)，從而有別于蠟狀芽胞桿菌(Bacillus?cereus,Bc)和炭疽芽胞桿菌(Bacillus?anthracis,Ba)。Bt首次由日本學(xué)者于1901年從家蠶幼蟲體內(nèi)分離得到，并于1915年正式命名為蘇云金芽胞桿菌(喻子牛，1990)，目前已經(jīng)有4萬(wàn)多株菌株被分離鑒定。實(shí)驗(yàn)證明，蘇云金芽胞桿菌對(duì)包括鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目等昆蟲綱的500多種昆蟲具有毒殺作用，另外，它還可以有效地防治原生動(dòng)物門、線形動(dòng)物門、扁形動(dòng)物門、瘧原蟲、血吸蟲、螨類等多種蟲害(Schnepf?H?E,Crickmore?N,Rie?J?V，Lereclus?D,Baum?J,Feitelson?J,Zeigler?D?R,Dean?D?H.1998.Bacillus?thuringiensis?and?its?pesticidal?crystal?proteins.Microbiol?Mol?Biol?Rev,62:775-806)，因此蘇云金芽胞桿菌被廣泛應(yīng)用與農(nóng)林業(yè)重要害蟲的生物防治和轉(zhuǎn)基因抗蟲育種，并且保持了近90年的安全使用記錄。?

1981年，Schnepf和Whiteley首次從蘇云金芽胞桿菌庫(kù)斯塔克亞種菌株HD-1中分離了第一個(gè)殺蟲晶體蛋白基因，此后人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)并鑒定了多個(gè)新的殺蟲基因，并且將其成功地應(yīng)用到微生物殺蟲劑及轉(zhuǎn)基因作物的領(lǐng)域，因此克隆新的殺蟲基因一直是蘇云金芽胞桿菌研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。隨著新基因數(shù)目的增多，Crickmore等學(xué)者于1996年正式提出了蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白按氨基酸序列同源性進(jìn)行分類的新的分離系統(tǒng)，規(guī)定了命名規(guī)則及分類原則。其中cry基因必須是來(lái)自蘇云金芽胞桿菌，編碼伴胞晶體蛋白的殺蟲基因；cyt基因是一種編碼具有溶細(xì)胞活性的伴胞晶體蛋白，并與已知編碼Cyt蛋白有明顯的序列相似性的基因。根據(jù)全長(zhǎng)基因推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性將殺蟲晶體蛋白基因分為四個(gè)等級(jí)。級(jí)與級(jí)之間的分類界線為同源性95%、78%和45%(Crickmore?N,Zeigler?DR,Feitelson?J,Schnepf?E,van?Rie?J,Lereclus?D,Baum?J,Dean?DH.1998.Revision?of?the?nomenclature?for?the?Bacillus?thuringiensis?pesticidal?crystal?proteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:807-813)。?

殺蟲晶體蛋白是Bt菌株最主要的殺蟲物質(zhì)，目前已有200多個(gè)cry基因被鑒定克隆。傳統(tǒng)的cry基因的克隆方法主要包括：生物測(cè)定法、Southern雜交法、蛋白質(zhì)測(cè)序法、構(gòu)建文庫(kù)法、各種PCR技術(shù)等，然而上述方法存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力及特異性差等缺點(diǎn)。申請(qǐng)人所在的華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的葉?偉星博士利用第二代高通量測(cè)序技術(shù)建立了一種快速鑒定新型cry基因的方法，從而有效地克服了上述缺點(diǎn)，具體方法參見圖1及http://bcam.hzaubmb.org/BtToxin_scanner/。?