[發(fā)明專利]一種尿樣中肌氨酸的定量檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210154590.4
• 申請日: 2012-05-18
• 公開（公告）號: CN102662013A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李水軍;余琛;周菊珍;酈俊生;朱建民;賈晶瑩;劉罡一;張夢琪;茅曉寅
• 申請（專利權(quán)）人: 上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 俞宗耀;俞昉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬化學(xué)定量分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種肌氨酸的定量檢測方法，尤其涉及一種尿樣中肌氨酸的定量檢測方法。

背景技術(shù)

目前前列腺癌的篩查診斷方法主要包括血清前列腺特異抗原測定（PSA）、直腸指檢、經(jīng)直腸超聲檢查、前列腺組織穿刺活檢等。PSA篩查被認(rèn)為是預(yù)測前列腺癌最好的指標(biāo),并在臨床上廣泛應(yīng)用。但其特異性有限,有些前列腺增生和前列腺炎患者?PSA也會升高,誤診情況時有發(fā)生。前列腺系統(tǒng)性穿刺活檢是診斷前列腺癌最可靠的方法，屬于侵入性檢查，需要在B超引導(dǎo)下進行,檢查結(jié)果嚴(yán)重依賴于穿刺位置的準(zhǔn)確性。更為重要的是,已有的診斷方法往往使臨床腫瘤醫(yī)生能輕易地診斷出前列腺癌,卻無法判斷癌細胞的生物學(xué)特性是侵襲性還是非侵襲性，即判斷癌癥的危險性。而這有可能導(dǎo)致惡性前列腺癌患者喪失了最佳的治療機會。

通過檢測生物樣本中小分子或者大分子生物標(biāo)志物是疾病篩查與診斷的有效手段，對于疾病的早期診斷、治療和預(yù)后具有重要的參考價值和臨床意義。因此無論從解決臨床前列腺癌診治難題的角度出發(fā),還是從提高癌癥患者的生存率并降低治療成本的角度出發(fā),尋找特異性更高的生物標(biāo)志物,特別是能表征前列腺癌侵襲性的生物標(biāo)志物,都是臨床上亟需解決的問題。

肌氨酸是一種存在于人體肌肉和其他組織的天然氨基酸，為甘氨酸的代謝產(chǎn)物。研究表明，肌氨酸在侵襲性前列腺癌中含量顯著升高，且可在尿樣中檢測出來，66例前列腺癌患者和200例正常健康人尿肌氨酸水平分別為404?ng/mL和104?ng/mL，肌氨酸值在前列腺癌病例中明顯增加（p<0.001）。尿樣中肌氨酸及肌氨酸/肌酐比值的受試者工作特征曲線（ROC曲線）下面積分別為0.904和0.946。提示肌氨酸具有非常高的檢驗靈敏度和特異性。這使得肌氨酸成為前列腺癌非損傷性診斷的一個候選生物標(biāo)志物，也有可能成為新的更好的前列腺癌診斷標(biāo)志物。目前對于肌氨酸的檢測，分別采用高效液相色譜法、氣相色譜－質(zhì)譜法和液相色譜－質(zhì)譜法，主要缺陷是特異性差，難以實現(xiàn)肌氨酸與干擾物質(zhì)的完全分離，樣品的處理方法步驟比較復(fù)雜。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種尿樣中肌氨酸的定量檢測方法，能準(zhǔn)確靈敏地定量檢測尿樣中肌氨酸的含量。

為達到上述目的，本發(fā)明提供的一種尿樣中肌氨酸的定量檢測方法，其特征在于：

（1）尿樣乙腈稀釋：隨機取100?μL尿樣，加入20?μL濃度為50?μg/mL肌氨酸-d3內(nèi)標(biāo)工作液，加入200?μL乙腈，混旋30s，15000?rpm離心3?min，棄沉淀，吸取100?μL上清液與300?μL乙腈混合，轉(zhuǎn)移至進樣瓶，供分析測試；

（2）色譜分離：以硅膠鍵合相填料為分析柱，以水溶液為流動相A，乙腈溶液為流動相B，所述A相中含有0.02～0.4%甲酸和1～5mmol/L甲酸銨作為改性劑，流速為0.1～1?mL/min，等度洗脫或者梯度洗脫，將肌氨酸從分析柱上洗脫，與其他干擾物質(zhì)實現(xiàn)色譜分離；

（3）質(zhì)譜檢測：采用電噴霧離子源串聯(lián)質(zhì)譜儀，在正離子檢測模式下，多反應(yīng)監(jiān)測掃描分析，檢測肌氨酸；

（4）結(jié)果計算：以質(zhì)譜檢測獲得的肌氨酸峰面積或峰高度，按同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法計算肌氨酸在尿樣中的含量。

所述步驟（3）質(zhì)譜檢測離子源參數(shù)設(shè)置為肌氨酸檢測通道m(xù)/z?90/44，肌氨酸-d3檢測通道m(xù)/z??93/47，離子通道范圍為±0.5?m/z。

本發(fā)明定量檢測尿樣中肌氨酸的含量，屬于非損傷性檢測方法。采用乙腈稀釋處理尿樣，以硅膠鍵合相填料柱為分析柱，流動相添加甲酸和甲酸銨為改性劑，等度洗脫或者梯度洗脫，在正離子模式下，以多反應(yīng)監(jiān)測法測定，以肌氨酸質(zhì)譜檢測獲得的峰面積或峰高度，按同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法定量檢測。本發(fā)明能實現(xiàn)肌氨酸和內(nèi)源性干擾物完全分離而不相互干擾，肌氨酸的最低定量限可達100?ng/mL，方法的精密度（以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差計）小于12%，準(zhǔn)確度為87.8%-99.5%。方法的特異性、靈敏度、精密度和準(zhǔn)確性較高，且成本低廉、簡單快速，適用于臨床上低成本、大批量尿樣中肌氨酸定量檢測的要求。

附圖說明

圖1肌氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

以肌氨酸濃度為X軸，以肌氨酸與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為Y軸，經(jīng)過1/X權(quán)重處理，在濃度100?ng/mL至5000?ng/mL范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)為0.9998。

圖2尿樣中肌氨酸的色譜圖。

圖中1－肌氨酸色譜峰，2－干擾物色譜峰。由圖示可見，本發(fā)明能實現(xiàn)肌氨酸1和干擾物2的完全分離而不相互干擾，具有良好的色譜分辨能力。