[發明專利]用于造紙廢水生物處理的漆酶、編碼基因及其表達與應用

有效

• 申請號: 201210153015.2
• 申請日: 2012-05-17
• 公開（公告）號: CN102676550A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 鄭展望;楊瑾;徐甦
• 申請（專利權）人: 浙江商達環保有限公司
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C02F3/00;C02F103/28
• 代理公司: 杭州裕陽專利事務所(普通合伙) 33221
• 代理人: 應圣義

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及了一種用于造紙廢水生物處理的漆酶、編碼基因及其在造紙廢水生物處理中的應用。

背景技術

我國造紙工業年廢水排放量大，處理難度高，加上《制漿造紙工業水污染物排放標準》（GB3544-2008）的頒布和實施，造紙工業廢水的處理難度加大，處理費用大幅增加。隨著人們環保意識的增強，法律法規的不斷健全及造紙廢水的排放指標的不斷嚴格，造紙廢水的處理和達標具有重要的現實意義。

目前造紙廢水常用的處理方法主要有物理法和化學法，但無法徹底消除廢水中較難處理的物質，如纖維素、半纖維素、木質素和酚類化合物等。生物法是處理造紙廢水的一種最有效、最安全和最徹底的方法。

漆酶是一種結合多個銅原子的蛋白質，屬于銅藍氧化酶。漆酶作用底物相當廣泛，能夠對多種污染物如各種酚類染料、取代酚、氯酚、硫酚、雙酚、芳香胺等。在漆酶介體(?HBT、ABTS等)存在下，漆酶還可以催化降解與木質素相關的二苯基甲烷及二噁英等。

漆酶是近年發現在造紙工業中最具潛力的生物酶，具有催化氧化木素的能力。漆酶能選擇性地催化木質素降解，不會產生有毒物質，并且生產在常溫、常壓的溫和條件下進行，節約設備和能耗。因此漆酶在造紙工業廢水處理等方面有著非常巨大的應用前景。

從1983?年起人們陸續在生脂固氮螺菌(Azospirillum?lipoferum)、交替單胞菌(?Alteromonas?sp．MMB-1)、大腸桿菌(?Escherichia?coli?)、假單胞菌(Pseudomonas?sp．?KU03?)、黏質沙雷氏菌(?Serratia?marcescens)、球形芽孢桿菌(Bacillus?sphaericus)、極端耐堿芽孢桿菌(B．?halodurans)和暗藍鏈霉菌(?Streptomyces?cyaneus?)、天藍色鏈霉菌(?S．coelicolor)及沙鏈霉菌(?S．psammoticus)等一些菌株中均發現有漆酶活性。（汪春蕾等，2011）

由于缺乏再現環境條件的方法和培養基質，造成了絕大多數微生物難以被標準實驗室的方法復蘇和培養,?稱為未培養微生物(uncultured?microorganism)。使用標準微生物學培養技術對不同生境微生物可培養性的測定來看，海水中微生物可培養的約為0.001%～0.1%，淡水約為0.25%，土壤約為0.3%，活性污泥為1%～15%左右。也就是說，目前絕大部分自然環境微生物很難或不能通過傳統純培養分離方法得到其純培養。

因此，利用構建基因文庫的分子生物學方法來篩選新的高效漆酶基因，利用畢赤酵母組成型表達來提高漆酶的表達活力，對于促進漆酶在造紙廢水生物處理中的應用具有重要意義。

發明內容

本發明提供了一種從造紙污水處理廠的活性污泥中篩選出的新的漆酶基因，該基因能夠在酵母細胞中組成型表達。含有新的漆酶基因的酵母表達菌可在造紙廢水中繁殖并表達漆酶，從而對造紙廢水進行生物增效處理。

為了解決上述技術問題，本發明通過下述技術方案得以解決：

一種用于處理造紙廢水的漆酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，共544個氨基酸。具體的，所述基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示，全長為1662bp，GC含量為40.07%。

本發明涉及的漆酶基因，是一種新的基因，與同類基因沒有同源性。其編碼的漆酶是一種新的漆酶，與其他已報道的漆酶氨基酸序列相比，相似性小于40%。應當指出的是，對本發明的漆酶基因所編碼的氨基酸序列進行一個或多個氨基酸替換、插入或缺失所得到的功能類似物均屬于本發明的保護范圍。在已知本發明漆酶基因的情況下，本發明普通技術人員可按本領域常規方法構建載體、轉化、表達，獲得所述漆酶。

本發明還涉及含有所述漆酶基因的宿主菌。

本發明還涉及含有所述基因的重組載體，將含有所述基因的重組載體轉化至宿主菌（通常為酵母菌）中，進行表達，即可獲得本發明漆酶。

本發明還涉及所述基因在制備重組漆酶中的應用。

本發明還涉及所述的漆酶在造紙廢水生物處理中的應用，本發明的漆酶的最適溫度是30-40℃，最適pH為5-6。將基因工程菌進行擴大培養后，按0.05%的添加量添加到曝氣池中進行處理。

本發明由于采用了以上技術方案，具有顯著的技術效果：

本發明提供了一種新的漆酶基因，能夠在酵母菌中組成型高效表達，克服了傳統純培養技術及誘導表達的不足，可提高漆酶的表達活力，對于促進漆酶在造紙廢水生物處理中的應用具有重要意義。