[發(fā)明專利]快速檢測禽白血病抗原的試紙條及其制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210152290.2
• 申請日: 2012-05-15
• 公開（公告）號: CN102636646A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 秦愛建;錢琨;梁有志;尹麗萍;邵紅霞;金文杰
• 申請（專利權(quán)）人: 揚州大學(xué)
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/558
• 代理公司: 南京知識律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于生物技術(shù)檢測領(lǐng)域，具體涉及一種檢測禽白血病抗原的試紙條及其制備方法。

背景技術(shù)：

1.膠體金快速診斷技術(shù)的原理

膠體金（Colloidal?gold），是由金離子還原而成的許多單個金顆粒組成的懸乳液，膠體金顆粒是有一個基礎(chǔ)的晶核（原子金周圍包含有11個金原子的二十面體）及包圍在外的雙離子層構(gòu)成，緊連在金核表面的是內(nèi)層負(fù)離子（AuCl₂^-），外層離子層H⁺則分散在膠體間溶液（見圖1）。金顆粒表面所包圍的陰性電荷層，叫做zata電位，可以使膠體金顆粒之間相互排斥而使懸浮液保持穩(wěn)定。

膠體金顆粒可以從5-150nm不等，制備膠體金仍基于還原法，常用的有鞣酸、檸檬酸三鈉、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等各種有機(jī)或無機(jī)化合物。還原劑的濃度和還原力越高，那么所合成的膠體金顆粒就越小。膠體金2-5nm是桔黃色，10-20nm是酒紅色，大顆粒30-64nm是深紅色。小分子的膠體金顆粒基本上是圓球形，30-80nm為偏心圓形。

膠體金標(biāo)記，實質(zhì)上就是蛋白質(zhì)等高分子物質(zhì)被吸附到膠體金顆粒表面的過程。蛋白質(zhì)與金顆粒的結(jié)合機(jī)制大概有以下幾個方面：帶負(fù)電荷的金顆粒與蛋白質(zhì)上的帶正電的一些帶正電荷的氨基酸反應(yīng)，如賴氨酸；其次，蛋白質(zhì)通過疏水作用吸附于金顆粒表面；通過蛋白質(zhì)中半胱氨酸的硫殘基與金顆粒的電子層發(fā)生配位結(jié)合。在標(biāo)記后需要加入一定量的穩(wěn)定劑，常用的穩(wěn)定劑有牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG)、明膠和干酪素等封閉金顆粒未被占據(jù)的位點以減少非特異性反應(yīng)并穩(wěn)定懸膠溶液。

膠體金免疫快速診斷技術(shù)是在酶聯(lián)免疫吸附試驗、乳膠凝集試驗、單克隆抗體技術(shù)、層析分析技術(shù)、膠體金標(biāo)記技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上完善起來的一項固相標(biāo)記新型免疫檢測技術(shù)。膠體金快速診斷技術(shù)是以膠體金作為示蹤物或顯色劑，將膠體金標(biāo)記在抗體上，再利用抗原抗體的血清學(xué)反應(yīng)原理，把金顆粒連接到抗原上，當(dāng)抗原抗體反應(yīng)處達(dá)到一定密度時（即金顆粒10⁷個/mm²），出現(xiàn)肉眼可見的紅色斑點。膠體金標(biāo)記抗體實質(zhì)是抗體被吸附到膠體金顆粒表面的過程，且這種吸附屬于物理吸附，對抗體的生物活性影響很小，易獲得較高的標(biāo)記率；另外膠體金不屬于生物活性物質(zhì)，干擾檢測結(jié)果的因素大大減少。目前在檢驗中的應(yīng)用主要有2種形式：穿流形式，又稱為膠體金免疫滲濾試驗(Dot-immunogold?filtration?assay，DIGFA)；另一種為側(cè)向橫流形式，又稱為膠體金免疫層析試驗(Gold?immunochromatography?assay，GICA)。膠體金免疫滲濾試驗始于1985年，最初以酶作為標(biāo)記物。1989年Splelberg以膠體金為標(biāo)記物成功檢測了艾滋病病毒(HIV)抗體，確立了免疫滲濾試驗的基本技術(shù)，即主要以層析微孔膜(硝酸纖維素膜，稱NC膜)為固相載體，在NC膜上固定已知的抗原或抗體，封閉包被后，將其裝入免疫滲濾裝置(塑料小盒)中，加待測樣品，洗滌后用膠體金探針檢測相應(yīng)的抗原或抗體。塑料小盒一般為扁平形，里面裝滿吸水材料，盒分為底和蓋兩部分，蓋的中央有一直徑0.4~0.8cm孔，小孔下緊貼吸水墊料放置硝酸纖維素膜。

膠體金免疫層析技術(shù)原理與免疫滲濾技術(shù)基本一致，只是將原來的滲濾改為層析。它同樣以硝酸纖維素膜為固相載體，通過毛細(xì)管作用使樣品溶液在層析條上移動，并同時使樣品中的待測物質(zhì)與層析材料上待測物的受體發(fā)生高特異高親和性的免疫反應(yīng)。層析過程中免疫復(fù)合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域（檢測帶），通過直接可目測的標(biāo)記物膠體金而得到直觀的實驗現(xiàn)象（如顯色），而游離標(biāo)記物則越過檢測帶，達(dá)到與結(jié)合標(biāo)記物自動分離的目的。

2.禽白血病

禽白血病病毒可引起禽類各種良性和惡性腫瘤，為反轉(zhuǎn)錄病毒科。依據(jù)病毒囊膜糖蛋白的抗原性差異、病毒干擾實驗、宿主范圍和基因組的特性，禽白血病病毒已分類至10個亞群，分別命名為A至J亞群。本病尚無切實可行的治療方法，也沒有有效的疫苗。因此對本病最理想的防制措施是培育無ALV感染雞群。