[發明專利]一種喹乙醇殘留標示物高偶聯比的全抗原合成方法

有效

• 申請號: 201210151680.8
• 申請日: 2012-05-16
• 公開（公告）號: CN102675455A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 張景艷;李建喜;張凱;楊志強;王磊;王學智;張宏;孟嘉仁;秦哲
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K14/77;C07K14/795;G01N33/531;G01N30/02
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司 11249
• 代理人: 陸菊華

技術領域

本發明屬于免疫化學分析技術領域，具體涉及一種喹乙醇殘留標示物高偶聯比的全抗原合成方法。

背景技術

喹乙醇又稱喹酰胺醇，商品名為倍育諾、快育靈，有中度至明顯的蓄積毒性，對大多數動物有明顯的致畸作用，對人也有潛在的三致性，即致畸形，致突變，致癌，由于其在飼料及飼料添加劑中濫用所引起的食品安全問題備受關注，對喹乙醇及其殘留標示物3-甲基喹喔啉-2-羧酸（MQCA）殘留快速檢測試劑盒和膠體金試紙條的研究成為近年來國內熱點。3-甲基喹喔啉-2-羧酸為小分子物質，不能刺激動物機體產生免疫應答獲得抗體，需與大分子物質如牛血清白蛋白、卵清白蛋白、鑰孔戚血藍蛋白等聯接作為免疫全抗原。研究發現半抗原能否刺激機體產生高特異性的抗血清不僅決定于它與蛋白質的結合位點，而且取決于蛋白質上連接的半抗原數目。已有的3-甲基喹喔啉-2-羧酸全抗原合成方法都選用N,N'-二環已基碳二亞胺（DCC）作為催劑，但該催化劑的缺點是合成過程中容易產生的副產物N,N'-二環已基脲且不易除凈，該副產物對皮膚、眼晴有刺激性，引起發炎，所得全抗原的偶聯比一般只有10：1左右。目前國內尚未建立合理、可靠的喹乙醇殘留標示物全抗原偶聯比檢測方法，其偶聯比的測定方法主要為紫外分光光度法，該方法的專屬性不強，準確度不高。

發明內容

本發明的目的是提供一種安全性好、效率高、高偶聯比的3-甲基喹喔啉-2-羧酸全抗原的合成方法。

本發明獲得3-甲基喹喔啉-2-羧酸全抗原的合成方法如下：

在N,N'-二異丙基碳二亞胺存在下，3-甲基喹喔啉-2-羧酸與N-羥基琥珀酰亞胺發生酯化反應，反應產物再與載體蛋白偶聯，得到全抗原。

所述載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清白蛋白或鑰孔戚血藍蛋白。

合成路線為：

具體的合成過程為：將3-甲基喹喔啉-2-羧酸溶于二甲基甲酰胺中，再加入催化劑N,N'-二異丙基碳二亞胺，催化劑與3-甲基喹喔啉-2-羧酸的摩爾用量相等，然后加入過量的N-羥基琥珀酰亞胺，與其發生酯化反應得到酯化物。反應后，離心除去沉淀物，再向反應液中滴加溶有載體蛋白的pH為7.4的PBS緩沖液，酯化物與載體蛋白分子上的胺基發生偶聯反應得到全抗原。反應液置于超濾管中，離心、洗滌，除去未反應完全的小分子物質，采用pH為7.4的PBS緩沖液洗滌。

進一步，所述3-甲基喹喔啉-2-羧酸與N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾用量比為1：（1.5～2），優選1：1.6。

酯化反應時的反應溫度為30～45℃，優選37℃。

偶聯反應時的反應溫度為30～45℃，優選37℃。

采用上述合成方法制得的3-甲基喹喔啉-2-羧酸全抗原的偶聯比的檢測方法：將上述含全抗原的反應液置于超濾管中，離心、洗滌，收集濾液，采用高效液相色譜法檢測濾液中游離3-甲基喹喔啉-2-羧酸的濃度，色譜條件：填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動相為體積比為60:40的甲醇水混合液，檢測波長為320nm。

采用上述合成方法制得的3-甲基喹喔啉-2-羧酸全抗原用于制備喹乙醇殘留標示物ELISA檢測試劑盒。

本發明有益效果：

（1）本發明在合成3-甲基喹喔啉-2-羧酸全抗原所用的催化劑為N,N'-二異丙基碳二亞胺（DIC），反應時較易形成均相反應，與催化劑N,N'-二環已基碳二亞胺（DCC）相比，其副產物少，安全性更高，不易造成操作人員的過敏，且最終所得的全抗原偶聯比可由10左右提高到32～68；

（2）在以往實驗中都采用透析法除去反應中的有害物質和雜質，通常需要在4℃，透析2～4天、PBS緩沖液4～8L。本發明應用分子截留量為30?000dal的超濾管離心純化MQCA全抗原，所需時間短，且耗費PBS緩沖液僅需4～8mL，為準確測定全抗原偶聯比提供了可行性。

（3）本發明選用高效液相色譜法檢測全抗原的偶聯比，該檢測方法的精密度符合要求，RSD=0.23%；重現性良好,?RSD=1.14%。