[發明專利]一種混合酶、酶切修飾試劑盒及構建載體的方法

無效

• 申請號: 201210151642.2
• 申請日: 2012-05-16
• 公開（公告）號: CN102676469A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 盛司潼
• 申請（專利權）人: 盛司潼
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N9/12;C12N15/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種混合酶，其特征在于，包括末端轉移酶和平末端限制性內切酶。

2.根據權利要求1所述的混合酶，其特征在于，所述末端轉移酶為野生型末端轉移酶或重組型末端轉移酶。

3.根據權利要求2所述的混合酶，其特征在于，所述重組型末端轉移酶為牛截短型末端轉移酶；所述牛截短型末端轉移酶與牛野生型末端轉移酶相比，其N端被截去100至160個氨基酸。

4.根據權利要求1所述的混合酶，其特征在于，所述平末端限制性內切酶為AfeⅠ、AleⅠ、AluⅠ、BmgBⅠ、BsaBⅠ、BsrBⅠ、BstUⅠ、BstZ17Ⅰ、Cac8Ⅰ、CviKI-1、DpnⅠ、DraⅠ、Eco53KⅠ、EcoRⅤ、EcoRV-HFTM、FspⅠ、HaeⅢ、HincⅡ、HpaⅠ、HpyCH4Ⅴ、MlyⅠ、MscⅠ、Ms1Ⅰ、MspA1Ⅰ、NaeⅠ、NlaⅣ、NruⅠ、PhoⅠ、PmeⅠ、Pm1Ⅰ、PshAⅠ、PsiⅠ、PvuⅡ、PvuⅡ-HFTM、RsaⅠ、ScaⅠ、ScaⅠ-HFTM、SfoⅠ、SmaⅠ、SnaBⅠ、SspⅠ、SspⅠ-HF、StuⅠ、SwaⅠ、XmnⅠ和ZraⅠ中的至少一種。

5.根據權利要求1至4中任一項所述的混合酶，其特征在于，還包括末端轉移酶作用因子1。

6.一種酶切修飾試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括混合酶；所述混合酶包括末端轉移酶和平末端限制性內切酶。

7.根據權利要求6所述的酶切修飾試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括反應緩沖液，所述反應緩沖液為在25℃條件下pH值在7至8之間的含有Tris-醋酸、醋酸鉀、醋酸鎂的水溶液。

8.根據權利要求6所述的酶切修飾試劑盒，其特征在于，所述混合酶還包括末端轉移酶作用因子1。

9.根據權利要求6至8中任一項所述的酶切修飾試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括氯化鈷溶液。

10.根據權利要求6至8中任一項所述的酶切修飾試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括修飾物，所述修飾物為脫氧核苷酸、雙脫氧核苷酸、帶標記的脫氧核苷酸、帶標記的雙脫氧核苷酸、脫氧核苷酸類似物或雙脫氧核苷酸類似物。

11.一種構建載體的方法，其特征在于，包括以下步驟：

A.利用混合酶和修飾物，在第一酶切修飾體系中對前體核酸分子進行酶切和修飾，得到3’端含有突出末端的載體；

所述前體核酸分子為含有至少一個平末端限制性內切酶識別位點的雙鏈核酸分子；

所述修飾物為脫氧核苷酸、雙脫氧核苷酸、帶標記的脫氧核苷酸、帶標記的雙脫氧核苷酸、脫氧核苷酸類似物或雙脫氧核苷酸類似物；

所述混合酶包括末端轉移酶和平末端限制性內切酶。

12.根據權利要求11所述的構建載體的方法，其特征在于，所述第一酶切修飾體系包括反應緩沖液，所述反應緩沖液為在25℃條件下pH值在7至8之間的含有Tris-醋酸、醋酸鉀、醋酸鎂的水溶液。

13.根據權利要求11所述的構建載體的方法，其特征在于，所述修飾物為雙脫氧核糖核苷酸。

14.根據權利要求13所述的構建載體的方法，其特征在于，所述修飾物為雙脫氧胸腺嘧啶核糖核苷酸。

15.根據權利要求11至14中任一項所述的構建載體的方法，其特征在于，還包括以下步驟：

B.將3’端含有突出末端的靶核酸片段與步驟A的產物連接，得到含有靶核酸片段的重組載體；

所述靶核酸片段的3’端的突出末端與步驟A的產物的3’端的突出末端互補。

16.根據權利要求15所述的構建載體的方法，其特征在于，步驟B所述靶核酸片段的3’突出末端為脫氧腺嘌呤核糖核苷酸。

17.根據權利要求11至14中任一項所述的混合酶構建載體的方法，其特征在于，所述前體核酸分子為pUC57、pUC19、pUC18、pBR322、pBluescript?Ⅱ?KS（-）、pBluescript?Ⅱ?KS（+）、pBluescript?Ⅱ?SK（-）、pBluescript?Ⅱ?SK（+）、pTZ57R、pACYC184、pTZ19R中的任一種。