[發明專利]篩選生產底物廣泛性的腈水解酶的菌株的方法在審

申請號：	201210150111.1	申請日：	2012-05-15
公開（公告）號：	CN102690766A	公開（公告）日：	2012-09-26
發明（設計）人：	咸漠;張海波;劉煒;徐鑫	申請（專利權）人：	中國科學院青島生物能源與過程研究所
主分類號：	C12N1/20	分類號：	C12N1/20;C12N1/02;C12Q1/04;C12R1/38;C12R1/01
代理公司：	中科專利商標代理有限責任公司 11021	代理人：	王旭
地址：	266101 山***	國省代碼：	山東;37
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摘要：
搜索關鍵詞：	篩選生產廣泛性水解菌株方法
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【權利要求書】：

1.一種篩選生產底物廣泛性的腈水解酶的菌株的方法，其特征在于采用三羥基丙腈作為篩選壓力和氮源，將適合微生物生長的樣品經過活化、初級富集、再富集后經過Berthelot初篩、高壓液相復篩步驟后獲得生產底物廣泛性的腈水解酶的菌株，其中所述活化、初級富集、再富集后經過Berthelot初篩、高壓液相復篩步驟如下：

(1)活化步驟，將經水洗后的固體樣品的水洗液或者液體樣品于25℃～37℃放置12～24小時；

(2)初步富集步驟，在活化步驟后向樣品中添加1％～2％的含三羥基丙腈的選擇性篩選液體培養基；

(3)再富集步驟，取1ml經初步富集的樣品接種到選擇性篩選液體培養基中，在37℃繼續富集培養12～24小時后，取50～200μL富集培養液涂布于選擇性篩選培養基固體平板，經36～72小時獲得單菌落；

(4)Berthelot初篩步驟，將2.5g氫氧化鈉、18.7g磷酸氫二鈉和15.9g磷酸鈉溶于400mL水中，加入含250mg有效氯的次氯酸鈉溶液；用水稀釋，用磷酸或磷酸鈉調節pH為11.7，最后定容至500mL，得氫氧化鈉與次氯酸鈉復配液，即A液，將5.0g苯酚和0.025g亞硝基鐵氰化鈉溶于450mL水中，用水稀釋定容至500mL，制得苯酚與亞硝基鐵氰化鈉復配液，即B液，取菌體催化樣品待測樣1μL，加入A液、B液各50μL以及100μL雙蒸水，混合均勻，37℃恒溫并震蕩反應20min，測定612nm處吸光度；

(5)高壓液相復篩步驟：使用儀器為：Waters?2545HPLC(Milford，MA，USA)，色譜柱為Aminex?HPX-87H(300mm×7.8mm，USA)。色譜條件為：進樣量為10μl，流動相為0.005M?H₂SO₄，流速為0.3～0.5ml?min^-1，柱溫為35℃。

2.如權利1要求所述方法，其中所述樣品為土壤、有機污染物、水體樣品，及其它富含微生物的樣品。

3.如權利2要求所述方法，其中所述土壤樣品取自垃圾場或廢水處理廠周圍的土壤。

4.如權利1要求所述方法，所述固體樣品水洗的固液質量比為1∶5～1∶10。

5.如權利1要求所述方法，其中所述選擇性篩選液體培養基的成分是：葡萄糖3～7g/l，K₂HPO₄0.5～2g/l，KH₂PO₄1～3g/l，MgSO₄·7H₂O?0.1～0.3g/l，NaCl?0.5～2g/l，FeSO₄·7H₂O?0.001～0.002g/l，CaCl₂0.001～0.002g/l，三羥基丙腈0.5～1.5g/l，pH?7.0～7.4。