[發明專利]一種克隆類家蠶絲素蛋白非結晶區基因的方法

無效

• 申請號: 201210149947.X
• 申請日: 2012-05-15
• 公開（公告）號: CN102703488A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 王建南;裔洪根;黃海燕;楊云星;李明忠;盧神州
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12R1/19
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 常亮;李辰

1.一種克隆類家蠶絲素蛋白非結晶區基因的方法，其特征在于，包括以下步驟：

A、合成分別編碼SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:2、SEQ?ID?NO:3所示的氨基酸序列的Link1、Link2、Link3三個雙鏈DNA分子；其中Link1的5’端和3’端分別含有BglII和NheI的粘末端堿基；Link2的5’端和3’端分別含有SpeI和HindIII的粘末端堿基，緊接HindIII位點的上游含有NheI位點；Link3的5’端和3’端分別含有SpeI和HindIII的粘末端堿基；

B、將Link1、Link2、Link3連接到質粒pSLFA1180FA中，轉化感受態細胞，挑克隆，抽提質粒，酶切篩選并測序鑒定獲得正確質粒，NheI/HindIII雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳回收小片段即得。

2.根據權利要求1所述克隆方法，其特征在于，所述將Link1、Link2、Link3連接到質粒pSLFA1180FA中的具體步驟包括：

a、用限制性核酸內切酶NheI/BglII消化質粒pSLFA1180FA，收集大片段，與雙鏈DNA分子Link1混合，T4DNA連接酶連接后得到質粒PSL1；

b、用限制性核酸內切酶NheI/HindIII消化質粒PSL1，收集大片段，與雙鏈DNA分子Link2混合，T4DNA連接酶連接后得到質粒PSL2；

c、用限制性核酸內切酶NheI/HindIII消化質粒PSL2，收集大片段，與雙鏈DNA分子Link3混合，T4DNA連接酶連接即得。

3.根據權利要求1所述克隆方法，其特征在于，所述雙鏈DNA分子Link1的編碼鏈具有如SEQ?ID?NO:5所示的核苷酸序列。

4.根據權利要求1所述克隆方法，其特征在于，所述雙鏈DNA分子Link2的編碼鏈具有如SEQ?ID?NO:6所示的核苷酸序列。

5.根據權利要求1所述克隆方法，其特征在于，所述雙鏈DNA分子Link3的編碼鏈具有如SEQ?ID?NO:7所示的核苷酸序列。

6.一種克隆多倍類家蠶絲素蛋白非結晶區基因的方法，其特征在于，包括以下步驟：

I、合成分別編碼SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:2、SEQ?ID?NO:3所示的氨基酸序列的Link4、Link5、Link6三個雙鏈DNA分子；其中Link4的5’端和3’端分別含有BglII和NheI的粘末端堿基，在緊接其BglII位點的下游含有AgeI的識別位點；Link5的5’端和3’端分別含有SpeI和HindIII的粘末端堿基，緊接HindIII位點的上游含有NheI位點；Link6的5’端和3’端分別含有SpeI和HindIII的粘末端堿基，在緊接其HindIII位點的上游含有NgoMIV的識別位點；

II、將Link4、Link5、Link6連接到質粒pSLFA1180FA中，得到含有單倍類家蠶絲素蛋白非結晶區基因的質粒F(1)；

III、用限制性核酸內切酶BamHI/AgeI消化步驟II得到的質粒F(1)，收集大片段，與BamHI/NgoMIV消化質粒F(1)獲得的小片段混合，T4DNA連接酶連接得到含有二倍類家蠶絲素蛋白非結晶區基因的質粒F(2)；

IV、重復步驟III，用限制性核酸內切酶BamHI/AgeI消化質粒F(1)，收集大片段，與BamHI/NgoMIV消化質粒F(2)獲得的小片段混合，T4DNA連接酶連接得到含有三倍類家蠶絲素蛋白非結晶區基因的質粒F(3)；用限制性核酸內切酶BamHI/AgeI消化質粒F(2)，收集大片段，與BamHI/NgoMIV消化質粒F(2)獲得的小片段混合，T4DNA連接酶連接得到含有四倍類家蠶絲素蛋白非結晶區基因的質粒F(4)；

V、分別將質粒F(2)、F(3)和F(4)轉化感受態細胞，挑克隆，抽提質粒，酶切篩選并測序鑒定獲得正確質粒，AgeI/HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收小片段即得二倍、三倍和四倍類家蠶絲素蛋白非結晶區基因。