[發明專利]一種呋喃丹農藥生物熒光傳感器及其檢測方法

無效

• 申請號: 201210148696.3
• 申請日: 2012-05-15
• 公開（公告）號: CN102660490A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發明（設計）人: 于源華;喬玉龍;于化東;張昊;張曉;王巖;周帥;王保學
• 申請（專利權）人: 長春理工大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;G01N21/64
• 代理公司: 長春眾益專利商標事務所(普通合伙) 22211
• 代理人: 紀尚

技術領域

本發明屬于分子生物學與環境微生物領域。

背景技術

隨著農業科學的發展，農藥被廣泛使用。據統計，我國每年農藥的使用總量達50萬～60萬噸，其中約有80%的農藥直接進入到環境中，每年使用農藥的耕地面積在2.8億m2以上，而且在未來若干年化學農藥在農業生產中依然是重要的作物保護手段。農藥是一把雙刃劍，在減少了農作物的損失、提高經濟效益的同時，農藥在農產品中大量殘留給人們的生命和財產造了不可估量的損失。

呋喃丹農藥是目前大量使用的氨基甲酸酯類農藥中的一種高毒性的農藥，在農藥市場中占有非常重要的地位。在防治農作物病蟲害方面發揮巨大作用的同時，由于不規范的、不合理的使用，給生態環境帶來了嚴重的污染，含有大量農藥殘留的蔬菜和水果也給人的身體造成了極大的健康隱患。

目前對呋喃丹農藥的檢測方法主要采用GC、HPLC、GC-MS和LC-MS等傳統農殘檢測方法，但需要儀器昂貴、樣品前處理復雜、檢測周期長，難以現場實時有效的解決農藥殘留問題。

發明內容

本發明的目的是：提供一種呋喃丹農藥生物熒光傳感器及其檢測方法，它是一種具有良好特異性以及高靈敏度，能夠快速、簡單、準確的檢測呋喃丹農藥殘留的生物熒光傳感器及其檢測方法。

本發明的技術方案是：

將重組質粒pK-SX12-EGFP轉化進大腸桿菌HB101中，建立了一種綠色熒光蛋白基因（GFP）標記的生物熒光檢測系統，是將功能基因片段插入pKEGFP-2載體中EGFP基因上游的MCS位置，而pKEGFP-2載體中EGFP基因位于LacZ上游且反向。因此，載體中GFP的表達只受到其上游基因的影響。當環境中存在呋喃丹農藥時，可特異性識別功能基因片段，誘導啟動GFP蛋白表達，此時檢測熒光強度，并且在一定呋喃丹濃度范圍內熒光強度嚴格受到呋喃丹濃度的控制。

本發明的制取方法是：

1.?采用宏基因組學研究方法，使用BamHI限制性內切酶部分酶切菌株H5基因組，將酶切產物分別插入pKEGFP-2基因載體，在大腸桿菌HB101中建立了基因組文庫并保存。

2.?利用多功能微孔板檢測儀，進行熒光檢測。篩選出熒光增強率最高的克隆子，對該克隆子中含有的質粒進行了測序鑒定，確定407bp為具有響應信號的功能基因片段，命名為SX12，序列如下：

TTTCGAGGTTGGAGCTGAAGTAAAAGCTGCTTTTTGTGATAAATATCCTGAATTAGAGTCTGCATTTATGGTGGGACAAGTCGAGGATAAATATCAGGCAGACCTCTATGCGATTGCTCGATTTATTTTAAGTCGTTTAGGTGTTGAAACCGTTTTGGGTGGGGGACAGTGCTCTTATCAACAGGCGGATGAATTCTTTTCACATCGCCGTAATAGTAAAACAGGACGAATGGCAACGTTTGTATTTATGCAATAAATCACATCTTTATGCTGTTGATTCGCCTTGTTGTATCTAAAAATGTTAAACTTGAGCTAATTCATTGGTTTTTAAATTTTCCATGTCTGTTATTGAGCAAATTACTCCCCAAGTTAAAGTTTGTGTGATTTATCATAGTCCTTATGGTCAT

3．通過PCR技術擴增了末端含有SalI、XbaI酶切位點的功能基因片段SX12，將其插入pKEGFP-2，構建pK-SX12-EGFP質粒，并轉入大腸桿菌HB101感受態細胞中。

4.?對pK-SX12-EGFP功能驗證。用三個濃度的呋喃丹誘導培養含有pK-SX12-EGFP質粒的大腸桿菌HB101，檢測熒光強度（RFU），其熒光增加率隨呋喃丹濃度正相關。

本發明的有益效果是：利用分子生物學技術，建立了農藥呋喃丹降解菌株H5的基因組文庫，并篩選出對呋喃丹農藥具有響應信號的功能基因片段（命名為SX12），利用熒光標記技術構建pKEGFP-2載體，構建生物熒光傳感器，通過檢測熒光強度來對樣品中的呋喃丹農藥殘留定量及定性檢測分析，為呋喃丹農藥檢測提供技術和方法，在農藥殘留檢測領域有極大應用價值。

附圖說明

圖1?功能基因片段的篩選原理及方法示意圖????