[發(fā)明專利]力墀永肽及其在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用、制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210148560.2
• 申請日: 2012-05-15
• 公開（公告）號: CN103421103A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄧立;劉勇;袁勝濤;鄧韻蕾;丁冠文;孫立;段作營;陶冠軍;張爽
• 申請（專利權(quán)）人: 鄧立
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C12N15/29;C12N15/63;C12N15/81;A61K38/16;A61P35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

第一部分：技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，特別是涉及一種基因工程多肽及其在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用和制備方法。

第二部分：背景技術(shù)

天然抗菌肽是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具有生物活性的小分子多肽，通常是由20～60個(gè)氨基酸殘基組成的堿性小分子多肽，水溶性好，分子量大約為4000道爾頓左右，多數(shù)具有2～4個(gè)二硫鍵，并含有α螺旋或β折疊結(jié)構(gòu)。這類活性多肽多數(shù)具有強(qiáng)堿性、熱穩(wěn)定性以及廣譜抗菌等特點(diǎn)，少數(shù)抗菌肽具有抗病毒或抗腫瘤的作用。多數(shù)抗菌肽的等電點(diǎn)大于7，表現(xiàn)出較強(qiáng)的陽離子特征。力墀永肽是采用基因重組，工程菌表達(dá)得到的，具有抗腫瘤作用的一種抗菌肽。

從生物界分離到的抗菌肽可達(dá)750多種，它們分布極其廣泛，從病毒、細(xì)菌、植物、昆蟲、軟體動物、甲殼動物、兩棲動物、魚類、鳥類及哺乳動物等生物均有發(fā)現(xiàn)，不同來源的抗菌肽的作用范圍目前尚未有系統(tǒng)和深入的研究。近10年來，隨著動物及微生物抗菌肽理論與應(yīng)用研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)某些抗菌肽對部分真菌、原蟲、病毒及癌細(xì)胞等均具有強(qiáng)有力的殺傷作用，抗菌對正常哺乳動物細(xì)胞及昆蟲細(xì)胞無不良影響，但對癌細(xì)胞則有明顯殺傷作用。

植物源的抗菌肽在分離純化、抗菌特性、細(xì)胞毒性、理化性質(zhì)以及轉(zhuǎn)基因等許多方面的研究進(jìn)展也很快，發(fā)現(xiàn)了一大批理化性質(zhì)和抗菌特性各異的植物抗菌肽。部分植物源的抗菌肽對G⁺菌、G^-菌、真菌、酵母及哺乳動物細(xì)胞均有毒殺作用，尤其對植物病原具有良好活性，人們對于植物源的抗菌肽在藥物方面的應(yīng)用寄予了深厚的期望和好奇，特別是在人類疾病，如癌癥的治療上。比如源自槲寄生的槲寄生毒素(VtB)，氨基酸序列如Seq?ID?No.3所示，包括3個(gè)二硫鍵，其含有α螺旋和β折疊結(jié)構(gòu)，具有抗腫瘤的作用。

由于抗菌肽分子小，天然資源有限，分離提純存在一定的困難，足量的天然抗菌肽很難得到；抗菌肽的活性取決于多肽的空間結(jié)構(gòu)，而化學(xué)合成的多肽的空間結(jié)構(gòu)存在不確定性，所以不能得到具有活性的產(chǎn)品；基因工程菌是最有希望經(jīng)濟(jì)、足量獲得活性多肽的良好途徑，但是據(jù)報(bào)道高濃度的抗菌肽可殺滅絕大多數(shù)宿主細(xì)胞，同時(shí)在分泌表達(dá)過程中，抗菌肽容易被宿主菌的酶系統(tǒng)所降解，從而產(chǎn)生兩敗俱傷的情形，而無法真正獲得足量的表達(dá)產(chǎn)物。目前還沒有該類多肽的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)報(bào)道，也未見到準(zhǔn)確表達(dá)和獲得足量的該類多肽以供試驗(yàn)用的報(bào)道，更未見到其在癌癥治療方面的應(yīng)用報(bào)道。

第三部分發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明根據(jù)上述領(lǐng)域的空白和需求，提供一種源自槲寄生毒素VtB的變構(gòu)肽及其在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用與制備方法。

力墀永肽，其特征在于具有Seq?ID?No.1所示的氨基酸序列。

編碼上述力墀永肽的基因。

所述基因的核苷酸序列如Seq?ID?No.2所示。

含有上述基因的表達(dá)載體。

所述表達(dá)載體的骨架載體為pKLAC1。

上述力墀永肽的制備方法，其特征在于將上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到酵母感受態(tài)細(xì)胞中，發(fā)酵培養(yǎng)。

所述酵母感受態(tài)細(xì)胞為K.lactis?YCT799。

上述力墀永肽在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

所述藥物為液態(tài)注射劑。

本發(fā)明根據(jù)源自槲寄生的抗菌肽VtB，對其氨基酸序列Seq?ID?No.3進(jìn)行變構(gòu)，在其N端增加一個(gè)甘氨酸G，第19位和20位氨基酸殘基甘氨酸GG變?yōu)榘腚装彼酑C，去掉第23位精氨酸R，24位甘氨酸G，26位半胱氨酸C和27位丙氨酸A的氨基酸殘基，將第28位氨基酸殘基絲氨酸S改為蘇氨酸T，得到如Seq?ID?No.1所示的多肽，命名為力墀永肽，由43個(gè)氨基酸組成，分子量為4543.3Da，等電點(diǎn)9.01，疏水比率30％，凈電荷+5。含有幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)域與類凝聚素結(jié)構(gòu)域。通過變構(gòu)，改變了多肽的二硫鍵位置和空間構(gòu)象，使得分泌表達(dá)出的多肽非常穩(wěn)定，不會在發(fā)酵、純化和保存過程中被迅速降解，以保證得到高表達(dá)量的產(chǎn)物。通過變構(gòu)，增加了該多肽在動物體內(nèi)的半衰期，可取得更有效的活性效果。本發(fā)明從氨基酸序列及易制造性和穩(wěn)定性上改變了槲寄生毒素VtB。試驗(yàn)證明，本發(fā)明采用基因工程發(fā)酵培養(yǎng)方法制備的力墀永肽的產(chǎn)率達(dá)到1克/升；體內(nèi)藥物試驗(yàn)小鼠肉瘤S180表明，靜注20mg/kg力墀永肽對小鼠黑色素瘤的抑制率可達(dá)61.48％。

本發(fā)明根據(jù)上述Seq?ID?No.1所示的氨基酸序列，設(shè)計(jì)了編碼該氨基酸序列的基因序列，利用密碼子的兼并性，調(diào)整了核苷酸序列使其符合酵母表達(dá)系統(tǒng)對密碼子的偏好性而得到Seq?ID?No.2所示的核苷酸序列，有利于穩(wěn)定高效表達(dá)抗菌肽。