[發明專利]一種香蕉束頂病毒恒溫基因擴增快速檢測試劑盒及其使用方法

無效

• 申請號: 201210148062.8
• 申請日: 2012-05-14
• 公開（公告）號: CN102703604A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 黃俊生;彭軍;郭建榮;郭立佳;楊臘英;王國芬;梁昌聰
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

技術領域

本發明涉及微生物檢測領域，具體的說，本發明涉及一種香蕉束頂病毒恒溫基因擴增快速檢測試劑盒及其使用方法。?

背景技術

香蕉為芭蕉科芭蕉屬植物，是熱帶亞熱帶重要的經濟作物和糧食作物。香蕉束頂病毒(Banana?bunchy?top?virus，BBTV)是制約我國廣東、云南、海南等香蕉主要種植地區產業健康發展的重要因素之一。感病植株生長早期發病病株明顯矮縮，葉片狹小，直立狀，葉緣黃化，葉質硬脆，易折斷，主脈和葉柄表現長短不一，斷斷續續的深色條紋(俗稱“起青筋”)。孕穗后發病，如葉片已出齊，則不現“束頂”，葉片也不狹小、黃化，但幼嫩葉片主脈仍現“青筋”，抽出的花蕾直生，不結蕉或結蕉性能極差，把柄細長、彎曲，果小而少，果端細如指頭，果肉脆、無香味。香蕉束頂病的病原為球狀粒體病毒(BBTV)，由香蕉蕉脈蚜(Pentalonia?nigronervosa)以持久性方式傳播。香蕉束頂病主要是通過吸芽和組培苗帶毒，以及香蕉交脈蚜(Pentalonia?nigroneryosa)來傳播。?

香蕉主要通過無性組織培養工廠化生產，香蕉束頂病毒可隨著組培中香蕉分化芽的繁殖，若種苗(或蕉頭)攜帶香蕉束頂病毒又未經嚴格檢疫，其病原就可能隨組培苗以更快的速度傳播，成為傳播病毒的一個重要的初侵染源。因此，建立一套BBTV快速、穩定的檢測方法是無毒種苗生產的重要保證。?

近年來，有大量的報道證實基于PCR的方法已經成功用于檢測香?蕉束頂病毒，PCR方法在操作時間上以及檢測的特異性和靈敏度方面較常規方法有較大提高，但是，PCR方法必須有精密的溫度循環裝置，而且它的檢測時間也還是比較長(2～3小時)，并且反應過程很容易受污染物的影響，從而使得這種方法不能滿足實際檢測的需要。因此，需要開發一種靈敏度高并且反應迅速的方法，在一定程度上可以取代PCR的檢測方法。因此，將生物技術發展的最新成果應用于香蕉束頂病毒檢測，具有重要意義。?

DNA環介導恒溫核酸擴增技術(loop-mediated?isothermal?amplification?of?DNA，LAMP)克服以往基因擴增方法的不足，在等溫條件下能夠特異性、高效、快速地進行核酸的擴增，具有很多的優越性，見文獻Notomi?T，Okayama?H，Masubuchi?H，Yonekawa?T，Watanabe?K，Amino?N，Hase?T.Loop-mediated?isothermal?amplification?of?DNA.Nucleic?Acids?Res.2000Jun?15；28(12)：E63.。該方法通常是按如下步驟進行：步驟一、對被檢標本進行預處理，快速提取被檢標本的DNA或RNA；步驟二、特異性引物的制備：確定待測標本的靶基因后，取得特異性引物2對，內引物和外引物各一對；步驟三、進行環介導等溫擴增技術(LAMP)反應：將經前處理的樣品、引物、反應緩沖液與Bst?DNA聚合酶混合，在63～65℃保溫0.5至1.5小時進行循環鏈置換反應；步驟四、分析判斷反應產物結果。?

發明內容

本發明的目的在于克服上述技術缺陷，提供一種香蕉束頂病毒恒溫基因擴增快速檢測試劑盒。?

本發明的目的還在于提供該香蕉束頂病毒恒溫基因擴增快速檢測試劑盒的使用方法。?

為了實現本發明的目的，本發明提供一種香蕉束頂病毒恒溫基因擴增快速檢測試劑盒，其試劑包括：?

由兩對引物構成的引物混合液，所述兩對引物為：外引物1-F3，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1(5’-TGATGCGGGATGAGTTTA-3’)所示，外引物2-B3，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2(5’-CACGCATATCCTGTATGAC-3’)所示，內引物1-FIP，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3(5’-CTTTCGTTTCTCAAGGTGTGCGTCGAGATGAAGAGAAGAAG-3’)所示，內引物2-BIP，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：4(5’-GGGAGCCAAGAAGAAGCAGGACCTTCGATTCTTGTATC-3’)所示，所述內引物1-FIP和所述內引物2-BIP的濃度均為40pmol/μl，所述外引物1-F3和所述外引物2-B3的濃度分別為5pmol/μl；?

濃度為8U/μl的BstDNA聚合酶；?

DNA提取液，所述DNA提取液包含：100mM?Tris-HCl(pH7.4)、1M?KC1、10mM?EDTA和2％(w/v)PVPP；?