[發(fā)明專利]分析VC生產(chǎn)菌株傳代過程中小分子代謝物變化的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210148033.1
• 申請日: 2012-05-14
• 公開（公告）號: CN102680562A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 元英進;李霞;鄒旸;胡夢龍
• 申請（專利權(quán)）人: 天津大學
• 主分類號: G01N27/62
• 分類號: G01N27/62
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 陸藝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域，涉及一種分析維生素C生產(chǎn)菌株混菌傳代培養(yǎng)過程小分子代謝物變化的方法。

背景技術(shù)

隨著經(jīng)濟發(fā)展和人民生活水平的提高，維生素C(VC)在食品、藥品等方面的需求逐年增加。目前，我國多為“二步發(fā)酵法”生產(chǎn)維生素C。第一步發(fā)酵使用黑醋桿菌將山梨醇轉(zhuǎn)化為L-山梨糖，第二步發(fā)酵為巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌混合發(fā)酵，將山梨糖轉(zhuǎn)化為維生素C的前體2-酮基-L-古龍酸。其中，第二步發(fā)酵中巨大芽孢桿菌為伴生菌，氧化葡糖桿菌為產(chǎn)酸菌。兩菌在混合發(fā)酵的過程中，通過相互作用促進產(chǎn)酸菌的生長和產(chǎn)酸。通過混菌傳代培養(yǎng)，混菌發(fā)酵生產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸的能力得到提高，但其作用機理尚不明確。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種分析檢測維生素C生產(chǎn)菌株傳代培養(yǎng)過程中小分子代謝物變化的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

一種分析維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程中小分子代謝物變化的方法，包括如下步驟：

（1）混菌傳代培養(yǎng)：

①固體培養(yǎng)：

取保藏于體積濃度為15-30%的甘油水溶液中的氧化葡糖桿菌（Gluconobacter?oxydans）和保藏于體積濃度為15-30%的甘油水溶液中的巨大芽孢桿菌(Bacillus?megaterium)分別接種于固體培養(yǎng)基上，28-35℃，培養(yǎng)24-48h；

②種子培養(yǎng)：

將經(jīng)步驟（1）①培養(yǎng)的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌分別轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在28-35℃，200-280rpm搖床振蕩培養(yǎng)24-48h，分別得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；

將巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌接種到一個新的種子培養(yǎng)基中，使巨大芽孢桿菌的密度為2×10⁷-2×10¹⁰CFU/mL，使氧化葡糖桿菌的密度為2×10⁸-2×10¹¹CFU/mL，在28-35℃，200-280rpm搖床振蕩培養(yǎng)，以24-48h為傳代周期，以體積比為1%-10%為傳代比接入新的種子培養(yǎng)基中，傳代100-150天得到混菌細胞，在傳代0-100天或0-150天中選定3-5個時間取樣，取3-5個樣；

③分純：

將步驟（1）②獲得的3-5個樣的混菌細胞劃線分純后再分別接種于固體培養(yǎng)基上，28-35℃培養(yǎng)24-48h；再分別轉(zhuǎn)入新的種子培養(yǎng)基，在28-35℃，200-280rpm搖床振蕩培養(yǎng)24-48h，分別得到進化了的巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；保藏于體積濃度為15-30%的甘油水溶液中；

④發(fā)酵：

將步驟（1）③獲得的進化了的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌以及將兩種菌混合在一起的混合菌，分別接種到新的種子培養(yǎng)基中，使進化了的巨大芽孢桿菌的密度為2×10⁷-2×10¹⁰CFU/mL，進化了的氧化葡糖桿菌的密度為2×10⁸-2×10¹¹CFU/mL，在28-35℃，200-280rpm搖床振蕩培養(yǎng)10-15h；

（2）胞內(nèi)小分子代謝物樣品的制備和測定：

①各取在步驟（1）④獲得的三種細胞懸液100–200mL，分別在1000–3000rpm離心3–10min，去除上清液，保留細胞，用pH=7.2–7.4的磷酸鹽緩沖液洗細胞1–3次，相同條件離心，去除上清，得到細胞；

②將步驟（2）①所得細胞制成干粉，各稱取30–60mg細胞干粉，分別置于三個離心管中，再加入0.5–1.5mL提取液，加入30-70μL濃度為0.020-0.060mg/mL氘標記的琥珀酸甲醇溶液為內(nèi)標物，混勻；1000–3000rpm離心3–10min，取上清液置于三個新的離心管中冷凍干燥；

③將步驟（2）②獲得三個離心管中分別加入40-100μL濃度為10-30mg/mL的甲氧基胺鹽酸鹽的吡啶溶液于30℃-40℃水浴中肟化反應(yīng)60-120min；再加入50-100μLN-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于35℃-40℃水浴進行硅烷化反應(yīng)30-60min；

所述提取液為體積分數(shù)為50-70%的甲醇水溶液；

④GC-TOF/MS檢測：