[發明專利]H1N1亞型禽流感病毒RT-LAMP可視化檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201210147567.2
• 申請日: 2012-05-14
• 公開（公告）號: CN102649984A
• 公開（公告）日: 2012-08-29
• 發明（設計）人: 謝芝勛;彭宜;劉加波;謝志勤;龐耀珊;鄧顯文;謝麗基;范晴
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及H1N1亞型禽流感病毒RT-LAMP可視化檢測試劑盒。

背景技術

禽流感（Avian?Influenza,AI）是禽流行性感冒的簡稱，是由正粘病毒科流感病毒屬A型禽流感流行性感冒病毒引起的一種禽類（家禽和野禽）傳染病。根據A型流感病毒表面糖蛋白（Hemagglutinin,HA）和神經氨酸酶（Neuraminidase,NA）的抗原性不同，禽流感病毒（AIV）可進一步分為不同的亞型，目前已發現有16種HA亞型和9種NA亞型。AIV是一種有包膜、單股負鏈、分節段的RNA病毒，病毒基因組由8個分節段負鏈RNA組成。AIV基因組的分節段特性使得兩種或兩種以上不同亞型流感病毒共同感染一個細胞時，子代病毒在裝配時其核酸片段可能以同源交換的形式發生基因重排而導致抗原轉變，從而產生能引起大流行的新流行株。人類歷史上幾次大流感的流行毒株（H2N2、H3N2）均是禽流感病毒與人流感病毒發生基因重排而產生，而H1N1亞型AIV傳播給人直接導致了1918年世界范圍內的毀滅性人類大流感流行。當前流行的甲型H1N1流感病毒的部分基因也來源于AIV。因此H1N1亞型AIV為低致病性AIV,但具有重要的公共衛生學意義。加強H1N1亞型AIV的檢測和監測，對保障人類健康意義重大，而快速簡便特異的檢測技術有助于H1N1亞型AIV的早期大規模診斷。

目前禽流感病毒常采用的檢測方法包括病毒雞胚分離、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、免疫熒光技術（IFA）、逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、實時熒光定量RT-PCR(RRT-PCR)、基因芯片(Gene?chips)。傳統的病毒雞胚分離方法準確、簡便，但耗時太長，通常需要兩天到一周的時間；IFA、ELISA快速但需要特殊試劑；RT-PCR、RRT-PCR、Gene?chips檢測技術快速、靈敏，但都需要特殊儀器和技術人員，且成本較高，不適合在基層推廣使用。

環介導等溫擴增技術(loop-mediated?isothermal?amplifi?cation,LAMP)是利用一種具有鏈置換活性和瀑布式核酸擴增功能的Bst?DNA聚合酶，在等溫條件下進行核酸的變性和自動循環的鏈置換核酸擴增反應，整個反應不需要特殊的儀器設備，僅在水浴鍋中就可完成。LAMP技術在目的基因保守區設計了針對8個特異區域的6條引物，使擴增反應具有很高的特異性。LAMP反應結果的觀察方法非常簡便，反應結束后可通過肉眼在可見光或紫外線下直接觀察反應液的顏色變化來判定結果。由于LAMP反應的擴增效率很高，在少量cDNA存在的條件下就可進行核酸的大量擴增，所以只需要在LAMP反應體系中加入反轉錄酶，通過逆轉錄環介導等溫擴增反應（RT-LAMP）就可以完成RNA的檢測。RT-LAMP具有簡便、快速、靈敏、特異的優勢，尤其適合在基層開展RT-LAMP試劑盒的應用推廣。RT-LAMP技術中，引物是決定檢測結果靈敏度和特異性的關鍵因素。

發明內容

本發明所要解決的一個技術問題是提供一種檢測或輔助檢測H1N1亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增成套引物。

本發明所提供的檢測或輔助檢測H1N1亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增成套引物，由簡并引物FIP-H1、簡并引物BIP-H1、簡并引物F3-H1、簡并引物B3-H1、簡并引物LF-H1、簡并引物LB-H1、簡并引物FIP-N1、簡并引物BIP-N1、簡并引物F3-N1、簡并引物B3-N1、簡并引物LF-N1和簡并引物LB-N1組成，它們的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10、序列11和序列12。

所述成套引物中，各簡并引物的摩爾比可為1.6μmol所述簡并引物FIP-H1、1.6μmol所述簡并引物BIP-H1、0.2μmol簡并引物F3-H1、0.2μmol簡并引物B3-H1、0.8μmol簡并引物LF-H1、0.8μmol簡并引物LB-H1、1.6μmol所述簡并引物FIP-N1、1.6μmol所述簡并引物BIP-N1、0.2μmol簡并引物F3-N1、0.2μmol簡并引物B3-N1、0.8μmol簡并引物LF-N1和0.8μmol簡并引物LB-N1。

所述摩爾比是總摩爾數之比，所述總摩爾數是簡并引物中各種單鏈DNA摩爾數之和。

本發明所要解決的另一個技術問題是提供一種檢測或輔助檢測H1N1亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑。