[發(fā)明專(zhuān)利]中藥復(fù)方二仙湯提取物改善更年期認(rèn)知功能

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210146802.4
• 申請(qǐng)日: 2012-05-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102641411A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-08-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 童瑤;施祖榮;張艷波;葉俊偉;張浩斌
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 童瑤
• 主分類(lèi)號(hào): A61K36/8964
• 分類(lèi)號(hào): A61K36/8964;A61P25/28
• 代理公司: 北京天奇智新知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11340
• 代理人: 朱培杰

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于藥學(xué)領(lǐng)域的現(xiàn)代中藥藥理學(xué)的研究。具體涉及中藥復(fù)方二仙湯提取物提高老年大鼠中海馬體及前額葉皮質(zhì)之BDNF水平，同時(shí)能促進(jìn)NMDA受體之表達(dá)，從而改善更年期引起的學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能衰退。

背景技術(shù)：

女性步入更年期后體內(nèi)雌激素水平隨之下降，而雌激素水平下降被認(rèn)為與各種更年期綜合癥之征狀有關(guān)，包括記憶力及學(xué)習(xí)能力等認(rèn)知功能的衰退。其中一些與認(rèn)知功能關(guān)系密切的分子，包括腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain-derived?neurotrophic?factor，BDNF)、TrkB受體及N-methyl-D-aspartate(NMDA)受體等與衰老的關(guān)系亦曾被報(bào)導(dǎo)。

二仙湯(EXD)由上海中醫(yī)藥大學(xué)張伯訥教授于50年代首先創(chuàng)立的中藥復(fù)方，臨床廣泛應(yīng)用于治療更年期綜合癥。

發(fā)明內(nèi)容：

本研究組在大鼠實(shí)驗(yàn)證明了二仙湯能激活芳香環(huán)轉(zhuǎn)化脢(Aromatase)之表達(dá)，藉此產(chǎn)生雌激素，所以減輕更年期綜合癥之癥狀，研究也發(fā)現(xiàn)，二仙湯不僅能幫助更年期女性產(chǎn)生雌激素，也能幫助增加BDNF分泌，同時(shí)促進(jìn)NMDA受體之表達(dá)，從而改善更年期引起的學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能衰退。

本發(fā)明首次通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，中藥復(fù)方二仙湯提取物能提高老年大鼠中海馬體及前額葉皮質(zhì)之BDNF水平，二仙湯同時(shí)能增加NMDA受體之表達(dá)。所以中藥復(fù)方二仙湯可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)用于女性因年紀(jì)增加而引致的學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能衰退，特別是對(duì)學(xué)習(xí)、記憶和思考的影響。

本發(fā)明的目的是為二仙湯提取物用于改善更年期引起的學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能衰退提供動(dòng)物研究水平的依據(jù)。發(fā)明人經(jīng)過(guò)多次藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方二仙湯仙茅、淫羊藿、巴戟天、當(dāng)歸、黃柏、知母以12∶12∶10∶10∶9∶9比例提取時(shí)，可有效對(duì)抗老年大鼠中海馬體及前額葉皮質(zhì)之BDNF水平和NMDA受體之表達(dá)下降。該藥理作用在本發(fā)明以前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

具體實(shí)施方式：

1)藥材制備二仙湯(EXD)由以下六種植物材料制成：仙茅，淫羊藿，巴戟天，當(dāng)歸，黃柏，知母(成分比例：12∶12∶10∶10∶9∶9)。煎2次，每次煎一小時(shí)，把兩次煎液混合。

2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物十二個(gè)月齡雌性SD(SD)大鼠被用作研究。雌性SD-大鼠，年齡8個(gè)月，購(gòu)自香港大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。動(dòng)物被安置在有空調(diào)的房間，溫度為24℃，相對(duì)濕度為50-65％，自動(dòng)12h光照：黑暗照明周期。大鼠飼養(yǎng)4個(gè)月至所需12個(gè)月月齡后喂藥。

3)藥物治療大鼠隨機(jī)分為EXD組、普力馬林(Premarin)組及對(duì)照組，每組4只。EXD組以EXD提取物灌(4.1g/kg)灌胃給藥。普力馬林組以西藥膠囊普力馬林(每粒含0.3mg雌激素)灌胃給藥(31.25mg/kg)。對(duì)照組喂服同等體積的水代替EXD。每天喂藥一次，連續(xù)8周后處死大鼠。取腦部海馬區(qū)及前額葉皮質(zhì)等部份并存放于-80℃作進(jìn)一步分析。

4)BDNF酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)BDNF酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)使用ChemikineTM?Brain?Derived?Neurotrophic?Factor(BDNF)Sandwich?ELISA?Kit(Millipore)試劑。大腦海馬體及前額葉皮質(zhì)中BDNF水平測(cè)定方法根據(jù)試劑盒內(nèi)之說(shuō)明進(jìn)行。

5)西方墨點(diǎn)法提取藥物治療組及對(duì)照組之大腦海馬體及前額葉皮質(zhì)中之蛋白并測(cè)定濃度。15mg的變性蛋白在8％十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離并轉(zhuǎn)移到聚二氟乙烯膜(PVDF)上，浸泡在5％牛血清蛋白中(Sigma)搖晃1小時(shí)，然后在4℃環(huán)境中與初級(jí)抗體培育過(guò)夜。是次檢測(cè)所用抗體包括、Anti-NR2A(Millipore)及Anti-GADPH(Millipore)。培育完畢后用TBS-T泡洗PVDF膜三次，再以次級(jí)抗體室溫培育1小時(shí)。培育完畢后用TBS-T額外泡洗PVDF膜三次后利用Bio-Rad?ChemiDoc系統(tǒng)以化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行西方墨點(diǎn)印跡檢測(cè)。光帶強(qiáng)度由Quantity-One(Bio-Rad)軟件量化再以GAPDH帶修正。

6)統(tǒng)計(jì)分析上述實(shí)驗(yàn)之?dāng)?shù)據(jù)以GraphPad?Prism?4軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

如圖1所示：前額葉皮質(zhì)中BDNF水平，數(shù)值以總前額葉皮質(zhì)中總蛋白水平修正。藥效組對(duì)比年老對(duì)照組以t-test檢測(cè)(N≥4，^*p＜0.05)。

如圖2所示：大腦海馬體中BDNF水平，數(shù)值以總前額葉皮質(zhì)中總蛋白水平修正。藥效組對(duì)比年老對(duì)照組以t-test檢測(cè)(N≥4，^*p＜0.05)