[發(fā)明專利]一種奇異變形桿菌菌株及其轉(zhuǎn)化大豆苷元生產(chǎn)S-雌馬酚的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210146746.4
• 申請(qǐng)日: 2012-05-11
• 公開（公告）號(hào): CN102925378A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 肖美添
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華僑大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12P17/06;C12R1/37
• 代理公司: 泉州市文華專利代理有限公司 35205
• 代理人: 車世偉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種奇異變形桿菌（Proteus?mirabilis）菌株（LH-52）及該菌株將大豆中富含的大豆苷元（daidzein）直接轉(zhuǎn)化為高活性植物雌激素S-雌馬酚（S-equol）的方法，屬于生物化工領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

大豆異黃酮具有與雌激素雌二醇類似的結(jié)構(gòu)，被廣泛稱為“植物雌激素（phytoestrogen）”。大量的研究發(fā)現(xiàn)以大豆苷元（daidzein）和染料木素(genistein)為主要成分的大豆異黃酮具有非常廣泛的生物學(xué)活性，除了雌激素樣作用外還具有抗氧化、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等功能。雌馬酚（equol）為大豆苷元的腸道菌代謝產(chǎn)物，相對(duì)于大豆苷元和染料木素而言，雌馬酚具有更高的雌激素活性和抗氧化活性。病理學(xué)研究表明equol在預(yù)防乳腺癌，前列腺癌，骨質(zhì)疏松癥以及更年期綜合癥方面有顯著療效。特別是作為雌二醇類似物，可以與雌激素受體結(jié)合，在治療更年期綜合癥以及乳腺增生、乳腺癌等雌激素分泌失調(diào)疾病上有顯著療效。?

然而Lampe?JW，Karr?SC,Hutchins?AM等的研究表明，由于腸道菌群、飲食結(jié)構(gòu)等的不同，大約只有30%~45%的人群體內(nèi)能產(chǎn)生equol，也就是說人類攝入大豆制品或者大豆異黃酮后，并非所有人都能在體內(nèi)產(chǎn)生equol，對(duì)于非雌馬酚產(chǎn)生者而言攝入大豆制品或大豆異黃酮所產(chǎn)生的健康效應(yīng)相對(duì)弱于雌馬酚產(chǎn)生者。因此研究雌馬酚的合成機(jī)制及篩選生產(chǎn)菌種，進(jìn)一步合成高生物活性的雌馬酚對(duì)人類健康而言具有重要的意義。?

雌馬酚具有兩種不同的手性結(jié)構(gòu)：R-equol和S-equol，其中?S-equol是生物天然合成的形態(tài)，與雌激素受體具有更強(qiáng)的結(jié)合力。S-equol對(duì)β-人體雌激素受體(β-Estrogen?Receptor，簡(jiǎn)稱β-ER)的親和力要比R-型雌馬酚高13倍、比消旋體雌馬酚(equol)高兩倍。雌馬酚的合成途徑目前主要有化學(xué)合成和生物合成兩種，其中化學(xué)方法合成的雌馬酚為外消旋體雌馬酚，而生物合成的雌馬酚全部為S-equol，因而生物合成法更適用于相關(guān)藥物和食品添加劑的生產(chǎn)。?

韓國(guó)專利PTC/KR2005/001285公布了一種能將二氫大豆苷元轉(zhuǎn)化為S-雌馬酚的革蘭氏陰性菌株Eggerthella?Julong?732，但該菌株卻不能直接將大豆苷元轉(zhuǎn)化為S-雌馬酚。二氫大豆苷元是大豆苷元的加氫還原產(chǎn)物，目前雖然能以大豆苷元為原料通過化學(xué)氫轉(zhuǎn)移法進(jìn)行合成，但價(jià)格昂貴。此外有文獻(xiàn)報(bào)道通過混合菌培養(yǎng)，先將大豆苷元轉(zhuǎn)化為二氫大豆苷元然后再使用Eggerthella?Julong?732將二氫大豆苷元轉(zhuǎn)化為S-雌馬酚，但此方法混合菌的接種比例以及接種時(shí)機(jī)難以控制，并且培養(yǎng)條件苛刻，比較難以實(shí)現(xiàn)。國(guó)內(nèi)專利CN?101338294B和CN?102021130A描述的不動(dòng)桿菌AUH-JLM455以及雙酶梭菌菌株為嚴(yán)格厭氧菌，相比較而言本發(fā)明的奇異變形桿菌為兼性厭氧菌，培養(yǎng)條件更為粗放，更適合于工業(yè)化生產(chǎn)。?

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供了一種奇異變形桿菌菌株LH-52及其轉(zhuǎn)化大豆苷元（daidzein）生產(chǎn)S-雌馬酚的方法。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的轉(zhuǎn)化制備S-雌馬酚難以實(shí)現(xiàn)的問題，提供一種能將潛手性化合物大豆苷元直接轉(zhuǎn)化為手性化合物S-雌馬酚的單一功能微生物菌株及其制備方法。相對(duì)于以往報(bào)道的嚴(yán)格厭氧雌馬酚轉(zhuǎn)化菌株以及混合菌轉(zhuǎn)化，本發(fā)明得到的奇異變形桿菌Proteus?mirabilis?LH-52菌株為兼性厭氧菌，更適合于工業(yè)生產(chǎn)。?

本發(fā)明為達(dá)到上述的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：?

一種奇異變形桿菌菌株LH-52，該LH-52菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國(guó).武漢.武漢大學(xué),保藏號(hào)為CCTCC?M?2011390，保藏日期為2011年11月13日。所述的奇異變形桿菌Proteus?mirabilis菌株LH-52的制備方法如下：?

1.樣品的采集?

取大鼠腸道盲腸5厘米內(nèi)的腸道內(nèi)容物，懸浮于生理鹽水中，過濾去除其中的固形物，然后取濾液200微升接種于新鮮滅菌的液體培養(yǎng)基中37℃厭氧活化培養(yǎng)24小時(shí)。其中所述的新鮮液體培養(yǎng)基配方為：蛋白胨27.5克/升，葡萄糖2.0克/升，氯化鈉5.0克/升，磷酸氫二鈉2.5克/升。?

2.樣品的抗生素抑制與特定功能菌株的分離篩選：?

（1）樣品的抗生素抑制?