[發(fā)明專利]一種蛋白A吸附介質(zhì)

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210146455.5
• 申請日: 2012-05-11
• 公開（公告）號: CN102698717A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳校園;余波光;楊正根;張海珍
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州康盛生物科技有限公司
• 主分類號: B01J20/24
• 分類號: B01J20/24;B01J20/26
• 代理公司: 珠海智專專利商標(biāo)代理有限公司 44262
• 代理人: 許淑文

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)及抗體吸附技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種蛋白A吸附介質(zhì)。

背景技術(shù)

蛋白A來源于金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁，全稱為金黃色葡萄球菌蛋白A，簡稱蛋白A或SPA。天然蛋白A的基因編碼序列由1464個(gè)堿基組成，共編碼488個(gè)氨基酸，分子量約42kd，包含E、D、A、B、C和X（從氨基端至羧基端）共六個(gè)結(jié)構(gòu)域。眾所周知，由于蛋白A能選擇性吸附人或哺乳動物的抗體（主要為IgG、也包括部分的IgA和IgM），因而被廣泛應(yīng)用于抗體純化、醫(yī)學(xué)診斷及臨床治療等多個(gè)領(lǐng)域。

在臨床治療方面，以蛋白A為配體的蛋白A吸附介質(zhì)被用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病，以及用于降低腎移植患者的抗體水平等，并取得了較好的療效。目前在國外市場上應(yīng)用的蛋白A免疫吸附柱產(chǎn)品（將蛋白A吸附介質(zhì)填裝于柱體中制成）主要有Prosorba和Immunosorba兩種，均為Fresenius?Medical?Care公司生產(chǎn)。由于蛋白A免疫吸附柱在臨床治療過程中屬于體內(nèi)應(yīng)用（屬于三類醫(yī)療器械），對人體具有潛在危險(xiǎn)，因而必須對其安全性、有效性進(jìn)行嚴(yán)格控制。但由于蛋白A吸附介質(zhì)在熱壓滅菌后會部分或完全失去抗體吸附性能，目前的蛋白A免疫吸附柱產(chǎn)品均未進(jìn)行最終滅菌，這無疑增加了產(chǎn)品的安全性風(fēng)險(xiǎn)，并導(dǎo)致必須對產(chǎn)品生產(chǎn)過程進(jìn)行更為嚴(yán)格的控制（即無菌生產(chǎn)工藝），使工藝流程更為復(fù)雜。事實(shí)上，目前尚未有能夠耐受熱壓滅菌的蛋白A吸附介質(zhì)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種可耐受熱壓滅菌的蛋白A吸附介質(zhì)，以解決蛋白A免疫吸附柱產(chǎn)品不能進(jìn)行產(chǎn)品最終滅菌的問題。

本發(fā)明所述的蛋白A吸附介質(zhì)是一種可耐受121.5℃、20分鐘熱壓滅菌的蛋白A吸附介質(zhì)，它是由固相載體材料和通過化學(xué)偶聯(lián)固定在載體上的配體構(gòu)成，所述配體是具有如序列表中SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列的重組蛋白A，并且由以下步驟制備：

a、將固相載體材料按質(zhì)量比1：1.5與0.2M高碘酸鈉溶液混勻，15-25℃振搖反應(yīng)4小時(shí)，用水洗滌干凈，抽干得到填料；

b、于步驟a所得的填料中加入含具有如序列表中SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列的重組蛋白A的硼酸鹽緩沖液，使每克填料對應(yīng)的重組蛋白A質(zhì)量不低于10mg，15-25℃振搖反應(yīng)8小時(shí)，用水洗滌干凈，抽干得到合成填料；

c、于步驟b所得的合成填料中按質(zhì)量比1：1.5加入含1%硼氫化鈉的PBS溶液，15-25℃振搖反應(yīng)4小時(shí)，用水洗滌干凈后即得。

根據(jù)本發(fā)明所述蛋白A吸附介質(zhì)的進(jìn)一步特征，所述固相載體材料是瓊脂糖凝膠微球。

附圖說明

圖1是重組蛋白A制備過程中各樣品的SDS-PAGE電泳圖，泳道1是超聲破碎細(xì)胞并離心后獲得的沉淀；泳道2是超聲破碎細(xì)胞并離心后獲得的上清；泳道3是低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，自上而下依次為97kd、66kd、44kd、29kd、20kd和14kd；泳道4為鈷離子螯合親和層析純化的穿流峰；泳道5為最終獲得的重組蛋白A；泳道6和7為鈷離子螯合親和層析純化的洗脫液；泳道8為經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)菌總蛋白。

圖2是編號為①的蛋白A吸附介質(zhì)在熱壓滅菌前后的血漿吸附試驗(yàn)的洗脫液的SDS-PAGE電泳圖，泳道1是熱壓滅菌前的吸附介質(zhì)的洗脫液；泳道2、3、4分別是熱壓滅菌后的吸附介質(zhì)在循環(huán)1、2、3的洗脫液；泳道5是低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，自上而下依次為97kd、66kd、44kd、29kd、20kd和14kd。

圖3是編號①~④的蛋白A吸附介質(zhì)在熱壓滅菌前后的抗體吸附量。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，這并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

一、重組蛋白A的制備

通過以下方法獲得重組蛋白A的基因編碼序列：

1、直接合成全序列（SEQ?ID?NO.2）；