[發(fā)明專利]TRPC6抗原多肽和抗TRPC6的單克隆抗體

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210145560.7
• 申請日: 2012-05-11
• 公開（公告）號: CN102659929A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張萃;劉曉波;李紅枝;黃超賢;梅儷凡
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東藥學(xué)院
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C12N5/20;C07K16/18;G01N33/68;G01N33/577
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛(wèi);郝文婷

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種TRPC6抗原多肽和抗TRPC6的單克隆抗體。

背景技術(shù)

TRPC6（瞬時(shí)受體電位陽離子通道6）蛋白是重要的足細(xì)胞膜蛋白之一，其基因突變產(chǎn)物可導(dǎo)致大量蛋白尿，從而引起局灶節(jié)段性腎小球硬化（FSGS）和進(jìn)行性腎衰竭。有研究發(fā)現(xiàn)在人類非遺傳性蛋白尿性腎臟疾病如FSGS、微小病變性腎病和膜性腎病患者中，TRPC6表達(dá)顯著增加，并且成群分布，有節(jié)段性密集型。FSGS是一種常見的腎小球疾病，人群發(fā)生率約為百萬分之二，其臨床特征為大量蛋白尿、腎病綜合征和進(jìn)行性腎功能不全。FSGS約占激素耐藥性腎病綜合征兒童的7~15%，占成人激素耐藥性腎病綜合征的15~20%。

FSGS是一種病理學(xué)診斷，其依據(jù)是光學(xué)顯微鏡下所描述的一種僅累及部分腎小球(局灶)的部分節(jié)段性血管袢的瘢痕形成模式(硬化)。該硬化可發(fā)生于多種情況，僅以光學(xué)顯微鏡下病理形態(tài)學(xué)特征命名的FSGS在臨床診斷治療方面均表現(xiàn)出極大的異質(zhì)性。由于免疫病理檢查可能因穿刺時(shí)未取到局灶性的硬化腎小球，或因病理切片制作數(shù)目過少而未觀察到節(jié)段性的硬化病灶，從而會(huì)導(dǎo)致FSGS的漏診。

目前用于檢測TRPC6的均為多克隆抗體，在應(yīng)用中非特異性結(jié)合因素多，難于評價(jià)和分析結(jié)果，而TRPC6單克隆抗體的制備可以克服這些局限性。此外，有關(guān)各組織TRPC6表達(dá)的測定多以mRNA檢測為主，沒有在蛋白水平上分析，利用TRPC6單克隆抗體構(gòu)建體外免疫學(xué)技術(shù)方法，測定蛋白水平的表達(dá)，更有利于疾病的分析與病情愈后監(jiān)測。

抗人TRPC6多肽單克隆抗體制備是采用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，該技術(shù)的基礎(chǔ)是細(xì)胞融合。骨髓瘤細(xì)胞與免疫的動(dòng)物脾細(xì)胞融合后，可形成能分泌針對單一抗原表位的均質(zhì)的高特異性的抗體，即單克隆抗體。由于骨髓瘤細(xì)胞在體外可以連續(xù)傳代，而脾細(xì)胞是終末細(xì)胞不能在體外增殖，因此將兩種細(xì)胞融合后既具有腫瘤細(xì)胞無限增殖特性，又具有淋巴細(xì)胞能分泌特異性抗體的能力，同時(shí)也克服了免疫淋巴細(xì)胞不能在體外增殖的缺點(diǎn)，融合的細(xì)胞被稱為淋巴細(xì)胞雜交瘤。

為了能建立簡便乙型的檢測方法對FSGS進(jìn)行診斷，首先需要篩選合適的TRPC6多肽序列，獲得良好的免疫原，但目前并沒有免疫原性好且特異性高的抗原多肽。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種TRPC6抗原多肽。

本發(fā)明的另一目的是提供一株能分泌抗上述TRPC6抗原多肽的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

本發(fā)明的又一目的是提供上述TRPC6抗原多肽的單克隆抗體。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的：

為了能建立簡便易行的檢測方法對FSGS進(jìn)行診斷，首先篩選合適的TRPC6多肽序列，獲得良好的免疫原，便可以制備抗TRPC6的單克隆抗體。基于單克隆抗體的優(yōu)勢可用于免疫學(xué)方法的構(gòu)建，可特異性的用于FSGS過程中TRPC6蛋白表達(dá)的測定。具體技術(shù)方案如下：

一種TRPC6抗原多肽，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。TRPC6蛋白共有931個(gè)氨基酸，經(jīng)過對其進(jìn)行穿膜區(qū)域、保守區(qū)域等多方面的研究，最終篩選確定15個(gè)氨基酸序列即KDLTKVTLGDNVKYY，作為抗原多肽，既避開了穿膜結(jié)構(gòu)，又具有高度的保守性（在人、大鼠和小鼠中均有）。

一株雜交瘤細(xì)胞株H8，是由上述TRPC6抗原多肽作為抗原制備得到，能夠分泌抗TRPC6的單克隆抗體，于2012年3月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC-C201236。

一種抗TRPC6的單克隆抗體，是由上述雜交瘤細(xì)胞株分泌得到的。

該抗TRPC6的單克隆抗體的制備方法如下：

（1）TRPC6抗原多肽合成，與KLH（keyhole?limpet?hemocyanin，血藍(lán)蛋白）歐聯(lián)后免疫小鼠；

（2）雜交瘤細(xì)胞株制備與篩選：取免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，培養(yǎng)，然后用常規(guī)間接ELISA檢測技術(shù)篩選，建立雜交瘤細(xì)胞株；

（3）單抗的純化及鑒定：對所得雜交瘤細(xì)胞株分泌的單抗進(jìn)行純化，可以采用辛酸-硫酸銨沉淀法或離子交換層析法純化，SDS-PAGE電泳分析純化結(jié)果，經(jīng)鑒定最終得到抗TRPC6的單克隆抗體。

上述抗TRPC6的單克隆抗體可作為體外免疫診斷試劑用于檢測與TRPC6分子表達(dá)相關(guān)疾病，如局灶性節(jié)段性腎小球硬化等。也可以用于TRPC6蛋白過表達(dá)的組織及疾病監(jiān)測，或經(jīng)改造人源化后與藥物偶聯(lián)進(jìn)行免疫靶向治療。