[發明專利]高熱穩定性華根霉脂肪酶

有效

• 申請號: 201210145501.X
• 申請日: 2010-08-13
• 公開（公告）號: CN102653741A
• 公開（公告）日: 2012-09-05
• 發明（設計）人: 喻曉蔚;徐巖;王睿
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12N15/55;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明涉及高熱穩定性華根霉脂肪酶，具體地說涉及利用分子生物學技術獲得熱穩定性提高的脂肪酶突變體，屬于酶的基因工程技術領域。

背景技術

脂肪酶（EC?3.1.1.3）不僅能催化油脂水解，也能在非水相中催化酯合成、轉酯化、酸解等反應，被廣泛地應用于化學，食品，制藥和洗滌劑或生物能源工業中。微生物是脂肪酶的一個重要來源，而根霉又是微生物脂肪酶的重要生產菌。如今，已有超過30種根霉脂肪酶實現了商品化生產。根霉脂肪酶大都具有高度1,3-位置選擇性，因此常用于油脂加工中。但是油脂加工通常需要在較高溫度下進行，而根霉脂肪酶屬于中溫脂肪酶，在65℃下的半衰期僅有15?min左右，熱穩定性差不僅限制了其應用范圍，而且易于失活，增加了生產成本。

定向進化屬于非理性設計，是指通過在實驗室中模擬達爾文自然進化過程，針對某一蛋白質酶的基因，通過改進的誘變技術改造的酶的基因，然后根據特定的改造目的，篩選有價值的天然酶。近10年來，定向進化技術已經在酯酶和脂肪酶性質改造領域取得巨大的成功，主要集中于提高酶的催化反應活性，改進底物特異性，提高熱穩定性，對映立體選擇性等方面（Johannes?TW?et?al.?Curr.?Opin.?Microbiol,?2006,?9:?261-267）。?

發明人在前期研究中成功從釀造濃香型大曲酒的酒曲中篩選到一株高產脂肪酶的華根霉（Rhizopus?chinensis?）CCTCC?M?201021菌株，并從該菌株中首次克隆得到脂肪酶基因序列，并實現該脂肪酶在巴斯德畢赤酵母（Pichia?pastoris）中的高水平分泌表達（Yu?Xiao-Wei?et?al.?J?Mol?Catal?B:?Enzym,?2009,?57:304-311）。本發明以華根霉脂肪酶基因為模板，利用定向進化技術獲得了熱穩定性顯著提高的脂肪酶突變體。

酶分子的熱穩定性提高可以用其半衰期（t₅₀）來體現。即酶的活力降低到原來活力一半時所需要的時間。半衰期長，則酶穩定性高。反之，則穩定性差。因此，t₅₀的提高代表了酶分子熱穩定性的提高。

????定義：

氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸殘基的公認IUPAC命名法，用三字母代碼形式。DNA核酸序列采用公認IUPAC命名法。

脂肪酶突變體的標識

采用?“原始氨基酸?位置?替換的氨基酸”來表示脂肪酶突變體中突變的氨基酸。如?Glu107Gly，?表示位置107的氨基酸由親本脂肪酶的Glu替換成Gly，位置的編號對應于附件序列表1?中親本華根霉脂肪酶RCL的氨基酸序列編號。

如?Leu180His/?Thr218Ser，表示位置180和位置218的氨基酸都發生了突變。

發明內容

本發明的目的在于提供高熱穩定性華根霉脂肪酶。

本發明的技術方案：高熱穩定性華根霉脂肪酶，由親本華根霉（Rhizopus?chinensis?）CCTCC?M?201021脂肪酶進行定向進化，通過易錯PCR、DNA?Shuffling和定點突變，獲得脂肪酶突變體，親本華根霉氨基酸序列SEQ?ID?NO:?1中在氨基酸取代位置發生突變，采用“原始氨基酸-位置-替換的氨基酸”來表示脂肪酶突變體中突變的氨基酸，所述脂肪酶突變體為：，

表1

華根霉脂肪酶氨基酸突變體的氨基酸序列為SEQ?ID?NO:?2，有22個突變氨基酸，底色標記顯示。

用于表達所述的脂肪酶突變體的表達載體為：pPIC9K，pPIC3.5K，pPICZα，pPICZ；

用于所述的表達載體轉化的微生物宿主細胞為畢赤酵母。

與親本華根霉脂肪酶相比，所述脂肪酶突變體的熱穩定性獲得了提高，以在65℃下的半衰期t₅₀來表示熱穩定性的提高，所述脂肪酶突變體的半衰期以及提高的倍數如下：?

表2

親本華根霉脂肪酶在65℃下的半衰期t₅₀為16.5?min。

本發明的有益效果：運用分子生物學方法對親本華根霉脂肪酶進行定向進化，通過易錯PCR、DNA?Shuffling和定點突變，獲得脂肪酶突變體，以半衰期t₅₀表示，脂肪酶突變體的熱穩定性得到了提高，如表2所示。

附圖說明