[發明專利]制備成熟胰島素多肽的方法

無效

• 申請號: 201210144295.0
• 申請日: 2006-08-15
• 公開（公告）號: CN102660614A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發明（設計）人: A·S·安德森;L·H·克里斯滕森
• 申請（專利權）人: 諾沃-諾迪斯克有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K14/62;C12N15/17;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/865
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 權陸軍;林森

1.通過培養含有編碼人胰島素類似物前體的DNA載體的真菌細胞來制備成熟人胰島素類似物的方法，其中所述前體含有連接肽，在所述連接肽兩側與胰島素肽A-和B-鏈的兩個接點處分別帶有切割位點，所述切割位點在真菌細胞內被切割，從而允許細胞向培養基中分泌正確加工的成熟、雙鏈人胰島素類似物。

2.根據權利要求1的方法，其中所述切割位點是Kex2切割位點。

3.根據權利要求1或2的方法，其中所述連接肽中對于與A-鏈接近的切割位點倒數第二位的氨基酸殘基選自Leu、Ile、Tyr、Arg、Lys、His、Pro、Met、Val、Ala和Phe。

4.根據權利要求3的方法，其中所述氨基酸殘基選自Leu和Ile。

5.根據權利要求1-4的方法，其中所述連接肽的大小為3-35、3-34、3-33、3-31、3-30、3-29、3-28、3-27、3-26、3-25、3-24、3-23、3-22、3-21、3-20、3-19、3-18、3-17、3-16、3-15、3-14、3-13、3-12、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5或3-4個氨基酸殘基。

6.根據權利要求1的方法，其中所述胰島素類似物具有在A8、B10、A18和A14位中至少之一的突變。

7.根據權利要求6的方法，其中所述突變選自Asp、Glu、His、Gln和Arg。

8.根據權利要求6的方法，其中所述胰島素類似物B10Glu、A8His、A14Glu人胰島素。

9.根據權利要求1-8的方法，其中該真菌細胞能夠向培養基中分泌至少約20至約50mg/L正確加工的成熟雙鏈人胰島素類似物。

10.根據權利要求1-8的方法，其中該真菌細胞能夠向培養基中分泌至少約20至約80mg/L正確加工的成熟雙鏈人胰島素類似物。

11.根據權利要求1-8的方法，其中該真菌細胞能夠向培養基中分泌至少約100mg/L正確加工的成熟雙鏈人胰島素類似物。

12.根據權利要求1-11的方法，其中所述真菌細胞是酵母細胞。

13.根據權利要求1的方法，其中所述人胰島素前體類似物具有氨基酸序列

B(1-30)-X-X-Z-Y-Y-A(1-21)

其中B(1-30)是人胰島素B-鏈或其類似物，A(1-21)是人胰島素A-鏈或其類似物，各X和各Y各自獨立為Lys或Arg或Yps1位點，且Z為1至約35個氨基酸殘基的肽序列，附帶條件是人胰島素A-和/或B-鏈中至少一個天然氨基酸殘基突變為另一個氨基酸殘基。

14.根據權利要求13的方法，其中Z的大小為3-35、3-34、3-33、3-31、3-30、3-29、3-28、3-27、3-26、3-25、3-24、3-23、3-22、3-21、3-20、3-19、3-18、3-17、3-16、3-15、3-14、3-13、3-12、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5或3-4個氨基酸殘基。

15.根據權利要求13的方法，其中X-X和Y-Y均為Kex2位點。

16.編碼具有以下氨基酸序列的胰島素前體的DNA序列

B(1-30)-X-X-Z-Y-Y-A(1-21)

其中，B(1-30)是人胰島素B-鏈或其類似物，A(1-21)是人胰島素A-鏈或其類似物，各X和各Y各自獨立為Lys或Arg或Yps1位點，且Z為1至約35個氨基酸殘基的肽序列，附帶條件是人胰島素A-和/或B-鏈中至少一個天然氨基酸殘基突變為另一個氨基酸殘基。

17.含有根據權利要求16的DNA序列的表達載體。

18.用根據權利要求17的載體轉化的酵母細胞。