[發明專利]萊茵衣藻三酰甘油合成限制基因CrPEPC1及其編碼蛋白與應用

無效

• 申請號: 201210143236.1
• 申請日: 2012-05-10
• 公開（公告）號: CN102660566A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發明（設計）人: 鄧曉東;費小雯;羅秋蘭;蔡佳佳
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/60
• 分類號: C12N15/60;C12N9/88;C12N1/13;C12R1/89
• 代理公司: 海口翔翔專利事務有限公司 46001
• 代理人: 莫臻

技術領域

本發明涉及一種能顯著抑制藻類中性脂合成的基因及其編碼蛋白與應用，特別涉及一種能顯著抑制萊茵衣藻中性脂含量的油脂代謝基因及其編碼蛋白與應用。?

背景技術

進入21世紀，經濟飛速發展，人類對石油等化石燃料的消耗日益增加，并且使用化石燃料帶來了嚴重環境污染問題，世界各國都在尋找安全的可再生能源。生物能源可以間接或者直接利用植物或微生物的光合作用，將太陽能固定為化學能，是可再生能源的首選。生物柴油和燃料乙醇是目前可以作為汽油添加劑進入市場的生物能源，其中生物柴油的成分更接近汽油，并且來源廣泛，成本低，是最有可能解決石油危機的可再生能源之一。?

生物柴油的制備主要是通過三酰甘油(TAG)與甲醇(乙醇)通過酯交換工藝制成。近年來生物柴油的產量在不斷增加，2008年全球生物柴油總量達到1110萬噸，預計到2016年生物柴油總產量達到12100萬噸，但是生物柴油的價格至今仍是居高不下。原料成本占據了生物柴油總生產成本的60-70％。目前生物柴油的原料有餐飲廢棄油、動植物油脂和微藻。利用微藻生產生物柴油具有無可比擬的優勢，已成為制備生物柴油的主要途徑。?

利用微藻來生產生物柴油有很多工藝步驟，其中優良藻種的選育是關鍵。最理想的生物柴油生產藻株要求生長迅速、含油量高且脂肪酸組成適宜制備生物柴油。目前的研究工作主要集中在藻種的分離，藻種含油量的測定，藻種脂肪酸成分的分析以及藻種的大規模培養上。與高等植物相比，微藻的TAG生物合成和積累的分子機制研究還很薄弱，關于TAG代謝網絡中相關基因功能研究報告更為稀少。萊茵衣藻是模式單細胞生物，基因組測序已經完成，在缺氮條件下油脂可以積累達到胞質的60％，是研究TAG代謝基因的理想藻株。?

PEPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)是一種細胞質酶，廣泛存在于光合生物中，可以催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和HCO3-生成草酰乙酸(OAA)和無機磷酸的不可逆反應。在C4植物中PEPC主要起固定CO2作用；而在C3植物和非光合作用組織中，PEPC主要起到回補損失的碳骨架作用。萊茵衣藻中存在兩種PEPC酶：PEPC1和PEPC2。前期研究表明PEPC2對微藻的中性脂合成具有負調控作用。日本學者Sugimoto等也發現大豆籽粒中PEPC活性與蛋白質含量密切相關。我國科學家陳錦清等受此啟發而提出“底物競爭”假說：大豆籽粒中的油脂和蛋白質之間存在著底物競爭，其共同底物為糖酵解的產物一丙酮酸，PEPC催化和HCO3-生成草酰乙酸(OAA)進入蛋白質合成途徑，而乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)則催化丙酮酸生成乙酰輔酶A進入脂肪酸合成途徑，二者的相對活性決定了底物的流向，進而決定蛋白質和脂肪在大豆籽粒中的比例。?

發明內容

本發明的目的是提供一種能抑制微藻中三酰甘油含量的基因及其編碼蛋白與應用。尤其是來自萊茵衣藻的基因。?

本發明所提供的能提高藻類三酰甘油含量的基因名稱為CrPEPC1?(Chlamydomonas?reinhardti?i?Phosphoenolpyruvate?carboxylase?isoform?1)，該基因在JGI萊茵衣藻基因數據庫的名稱為estExt_GenewiseW_1.C_280036，位于16號染色體3，641，705-3，648，177區域，含12個外顯子。蛋白ID?80312，編碼一個名為PEPC1(Phosphoenolpyruvate?carboxylase?isoform?1)的蛋白，是根據JGI萊茵衣藻基因數據庫上公布的CrPEPC1基因為模板設計特異性引物，擴增cDNA獲得全長序列，根據該堿基序列分析而推測編碼CrPEPC1蛋白的序列。對其研究發現該基因可以顯著降低萊茵衣藻中中性脂含量和生物量。本發明所述CrPEPC1基因，來源于萊茵衣藻，是下列核苷酸序列之一：?

1)序列表中SEQ?ID?NO：1DNA序列；?

2)編碼序列表中SEQ?ID?NO：2蛋白質序列的多核苷酸；?

3)與序列表中SEQ?ID?NO：1限定的DNA序列具有90％以上同源性且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。?

能降低微藻中性脂含量的基因CrPEPC1的編碼蛋白CrPEPC1，是具有序列表中SEQ?ID?NO：2氨基酸殘基序列的蛋白質，或者是將SEQ?ID?NO：2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ?ID?NO：2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ?ID?NO：2衍生的蛋白質。?