[發(fā)明專利]一種4-甲基咪唑完全抗原的合成方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210142457.7
• 申請(qǐng)日: 2012-05-09
• 公開（公告）號(hào): CN102675454A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 于淑娟;管永光;鄧麗卿;吳鑫蘭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/765
• 分類號(hào): C07K14/765;C07K14/77
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 徐嵩

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及4-甲基咪唑完全抗原，特別是涉及一種4-甲基咪唑-蛋白（BSA和OVA）的合成方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

4-甲基咪唑（中文別名為4-甲基咪唑，4-甲基甘啞啉，4-甲基-1H-咪唑），英文名4-Methylimidazole（縮寫4-Mel或4-MI），是一種含氮雜環(huán)化合物，分子式為C₄H₆N₂，是白色至類白色結(jié)晶粉末，溶于水和乙醇，有腐蝕性。它是合成多種藥物的重要醫(yī)藥中間體，還是生產(chǎn)農(nóng)用化學(xué)品、環(huán)氧樹脂固化劑染料工業(yè)乳化劑金屬防腐劑等多種產(chǎn)品的中間體。4-甲基咪唑是氨（銨）法焦糖色素生產(chǎn)中的副產(chǎn)物，這類色素被廣泛應(yīng)用于酒類、飲料、醬油、醋、醬菜、糕點(diǎn)、咖啡、巧克力、糖果、湯料、糖漿藥品等行業(yè)。然而，據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，4-甲基咪唑作為一種神經(jīng)毒素，具有強(qiáng)烈的致驚闕作用，能使動(dòng)物產(chǎn)生超興奮狀態(tài)，對(duì)反芻動(dòng)物有后天性的損害，可以令人發(fā)生痙攣；它對(duì)雄性小鼠的痙攣致死量為370mg/kg體重；同時(shí)，它可以誘發(fā)老鼠患肺癌，與雌性小鼠患白血病有一定的關(guān)聯(lián)。鑒于4－甲基咪唑?qū)θ梭w潛在的危害性，世界衛(wèi)生組織（WHO）對(duì)焦糖色素的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)做出了規(guī)定，焦糖色素中4-甲基咪唑的含量小于200mg/kg，中國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB8817-88中規(guī)定其在焦糖色素內(nèi)含量不得超過0.02％。因此，通過檢測(cè)食品藥品中的4-甲基咪唑含量，進(jìn)而控制其在食品藥品中的含量、確保食品藥品的安全，具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)4-甲基咪唑的檢測(cè)方法主要有：層析法、色譜法、分光光度法。層析法和分光光度法雖然操作簡(jiǎn)單快捷，但是其不能準(zhǔn)確定性定量，準(zhǔn)確度較低；色譜法可以非常準(zhǔn)確對(duì)4-甲基咪唑進(jìn)行定性和定量，但是其耗時(shí)長(zhǎng)，成本高，對(duì)被檢材料要求較高，并且需要專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行操作，費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代檢測(cè)對(duì)方便、快速、準(zhǔn)確的要求。目前，國(guó)內(nèi)尚無使用免疫快速檢測(cè)法檢測(cè)食品藥品中4-甲基咪唑含量的報(bào)道，為了彌補(bǔ)這一空白，為今后人們?cè)诿庖邫z測(cè)方面的研究提供材料，設(shè)計(jì)了4-甲基咪唑半抗原，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步設(shè)計(jì)了可用于免疫檢測(cè)用的4-甲基咪唑完全抗原。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明的目的是提供一種4-甲基咪唑完全抗原的制備方法，所制備的產(chǎn)品可用于食品藥品中4-甲基咪唑含量的免疫檢測(cè)，為后續(xù)研究、開發(fā)及應(yīng)用提供必需的人工抗原。

本發(fā)明是以4-甲基咪唑?yàn)樵希c乙醛酸、丙醛酸、丁醛酸、戊醛酸、己醛酸或?qū)θ┗郊姿岱磻?yīng)得到4-甲基咪唑半抗原，再以EDC和NHS為活化劑，將4-甲基咪唑半抗原與蛋白（BSA和OVA）結(jié)合在一起，制備4-甲基咪唑的人工抗原，即4-甲基咪唑-牛血清白蛋白和4-甲基咪唑-卵清白蛋白。

本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。

一種4-甲基咪唑完全抗原的合成方法，包括如下步驟：

（1）半抗原的制備：將4-甲基咪唑與有機(jī)酸混合后，溶解于溶劑中，配成4-甲基咪唑的質(zhì)量濃度為0.01g/mL～0.5g/mL，且有機(jī)酸的質(zhì)量濃度為0.05g/L～5g/mL的混合溶液，在0℃～70℃條件下反應(yīng)0.1h～24h，得到4-甲基咪唑半抗原；所述有機(jī)酸為乙醛酸、丙醛酸、丁醛酸、戊醛酸、己醛酸或?qū)θ┗郊姿幔凰鋈軇樗⒓状肌⒁掖肌MSO或DMF；

（2）半抗原的活化：將4-甲基咪唑半抗原溶于DMSO或DMF中，得到濃度為0.001～0.5g/mL的4-甲基咪唑半抗原溶液，在攪拌條件下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），使EDC和NHS在DMSO或DMF溶液中的質(zhì)量濃度為0.001～0.5g/mL，活化0.1～12h；

（3）偶聯(lián)蛋白溶液的制備：將牛血清白蛋白（BSA）或卵清白蛋白（OVA）溶解于磷酸鹽緩沖液中，配成偶聯(lián)蛋白濃度為0.001g/mL～0.5g/mL的蛋白溶液；

（4）人工抗原的合成：在攪拌條件下，蛋白溶液加入活化后的半抗原溶液中，在溫度為0℃～30℃條件下反應(yīng)0.5h～12h，得到人工抗原混合液；

（5）透析：將人工抗原混合液轉(zhuǎn)移到能透過分子量為1kDa~100kDa的透析袋中，在攪拌的條件下，使用磷酸鹽緩沖液透析1天~8天；透析結(jié)束后，干燥，得到固體狀的4-甲基咪唑完全抗原。

為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，步驟（2）所述的EDC與NHS的質(zhì)量比為5∶1～1∶5；

步驟（3）和步驟（5）所述的碳酸鹽緩沖液的濃度優(yōu)選為0.01～0.6mol/L，pH為5.0～9.0。