[發(fā)明專利]一種單增李斯特菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)用引物組和試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210142366.3
• 申請(qǐng)日: 2008-09-16
• 公開（公告）號(hào): CN102643923A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張明洲;陳宗倫;方美明;方結(jié)紅;龔云飛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)計(jì)量學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務(wù)所有限公司 33214
• 代理人: 王從友

????本發(fā)明申請(qǐng)是專利號(hào)為：200810121029.X，專利名稱為：?jiǎn)卧隼钏固鼐h(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)用引物、試劑盒和檢測(cè)方法，申請(qǐng)日為：2008-09-16?的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測(cè)試劑，具體涉及一種單增李斯特菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)用引物、試劑盒和檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria?monocytogenes,?Lm)?(以下簡(jiǎn)稱“單增李斯特菌”)是一種重要的人畜共患病致病菌，廣泛存在于土壤、動(dòng)物和水產(chǎn)品等，主要通過奶及奶制品、蔬菜、水產(chǎn)品、肉制品等食物傳播。該菌已被列為90年代4大食品致病菌之一，成為許多國(guó)家食品衛(wèi)生的必檢項(xiàng)目。

傳統(tǒng)的單增李斯特菌生化檢測(cè)方法全過程至少需要7～10?d，檢出限較低?，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。免疫法比較快，但單克隆抗體制備比較困難，易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，特異性差。而PCR或熒光定量PCR方法快速，特異、靈敏度很高，但需要昂貴的PCR儀。國(guó)外曾有少量文獻(xiàn)報(bào)道利用mRNA模板針對(duì)iap基因以RT?-?PCR檢測(cè)活體單增李斯特氏菌，但需要以膜雜交來顯示檢測(cè)結(jié)果，時(shí)間長(zhǎng)、技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)用高，不易推廣應(yīng)用。熒光染色技術(shù)可以對(duì)活菌進(jìn)行檢測(cè)，但技術(shù)復(fù)雜，需要高端儀器。因此建立一種簡(jiǎn)便、靈敏、快速、特異的方法很有必要。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增基因技術(shù)（loop-mediated?isothermal?amplication，簡(jiǎn)稱LAMP）（國(guó)際專利公開號(hào)WO?00/28082）是2000年Notomi等開發(fā)出的一種核酸擴(kuò)增新技術(shù)，針對(duì)待測(cè)靶基因序列的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)一套兩對(duì)特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶（Bst?DNA?polymerase）在65℃左右等溫條件下能夠特異性、高效、快速的進(jìn)行核酸擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果可直接對(duì)擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀通過肉眼進(jìn)行判斷或檢測(cè)其濁度，也可用結(jié)合雙鏈的熒光染料優(yōu)選SYBR?Green?I?染色，即可通過肉眼判定。由于LAMP技術(shù)擴(kuò)增的兩對(duì)引物是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)段，因而具有比PCR更高的特異性，同時(shí)是等溫條件下即不需PCR儀等特殊儀器，且樣品的前處理非常簡(jiǎn)單、單位時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增效率更高等優(yōu)點(diǎn)，已引起人們的關(guān)注。

中國(guó)發(fā)明專利（申請(qǐng)?zhí)枮椋?00710030435.0、200710030437.X、200710132320.2、200710026389.7、200810052321.0、200810015001.8、200810093986.6）分別公開了采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增基因技術(shù)檢測(cè)病菌的方法。但是，目前還沒有用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增基因技術(shù)檢測(cè)單增李斯特菌的試劑盒的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有單增李斯特菌的檢測(cè)方法不簡(jiǎn)便、靈敏低、時(shí)間長(zhǎng)、特異性差的技術(shù)缺陷。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種單增李斯特菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediatedisothermal?amplication?，LAMP）技術(shù)快速檢測(cè)用引物；本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供使用上述檢測(cè)用引物的試劑盒；本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供使用上述檢測(cè)用引物的試劑盒檢測(cè)方法。本發(fā)明的試劑盒和檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)便、靈敏、快速、特異好的特點(diǎn)，可廣泛用可廣泛用于食品、水產(chǎn)品、化妝品與醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域。

為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案：

單增李斯特菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)用引物，所述的引物為一套單增李斯特菌特征性引物組，一套引物組由兩對(duì)引物組成，一對(duì)引物為外引物，一對(duì)為內(nèi)引物，共有六套引物，序列分別為：

引物組一：

外引物1：CAAGCACTGTAGTAGTCGA

外引物2：CGTAATAATACTGTTATCAACACC

內(nèi)引物1：GTTTGCTTTTTTAATTGCGTCAACATTTTAGCTGGTGATACTCTTTGG

內(nèi)引物2：ACAAGTAAATAATGAGGTTGCTGCTTTTTCGGACGTTTAACCAAGTTG

或引物組二：

外引物1：GGTGATACTCTTTGGGGTAT

外引物2：CGTAATAATACTGTTATCAACACC

內(nèi)引物1：GACCTGGTACGATTTTATCTGTTGTTTTTCGCACAAAGTAAAGGGAC

內(nèi)引物2：ACAAGTAAATAATGAGGTTGCTGCTTTTTCGGACGTTTAACCAAGTTG

或引物組三：

外引物1：TTAAACGTCCGTACTGGC?

外引物2：CACTTCTTGTGTTGGTGC?