[發(fā)明專利]食品及加工品中蘿卜源性成分PCR檢測引物

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210142309.5
• 申請日: 2012-05-01
• 公開（公告）號: CN102732611B
• 公開（公告）日: 2017-02-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉彩霞;高宏偉;梁成珠;徐彪;孫敏;林超
• 申請（專利權(quán)）人: 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于一種利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)對食品加工品中植物源成分——蘿卜進行快速篩選與檢測的引物，蘿卜源成分快速檢測具體的是針對蘿卜特異性基因所用引物進行DNA檢查。應(yīng)用該引物能夠擴增出食品及食品加工品中摻加的蘿卜源性成分，反應(yīng)特異性強、靈敏度高、操作簡便、重復(fù)性好。

背景技術(shù)

蘿卜是一種質(zhì)脆味美的蔬菜，具有辛辣氣味，屬于十字花科。在食品未加工前，根據(jù)形態(tài)很容易將蘿卜和其他物種進行鑒別，但食品在進行加工處理后中，往往失去可鑒別的形態(tài)特征，一些企業(yè)為了節(jié)約成本以次充好甚至摻雜相近成分，經(jīng)多次混合加工后消費者難以目測辨別食品是否已摻加了蘿卜。食品中是否混有蘿卜源性成分，沒有一個公認(rèn)的判定方法或標(biāo)準(zhǔn)，降低消費者的生活質(zhì)量。2010年9月，韓國駐華大使館向國家質(zhì)檢總局有關(guān)部門通報了我國輸韓蒜泥制品中有摻雜蘿卜原料進行加工的情況，輸韓蒜泥制品中有檢出蘿卜成分摻假。為保障消費者權(quán)益，避免出現(xiàn)用蘿卜進行摻假的情況，需要開發(fā)一種快速有效的檢測蘿卜的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對蘿卜中orf?B基因設(shè)計一組特異性引物，建立一種快速篩選和檢測蘿卜中基因成分PCR檢測方法，克服基于外部形態(tài)或蛋白的檢測方法在蘿卜等深加工產(chǎn)品檢測中的局限性，為食品加工品中可能含蘿卜的產(chǎn)品檢測提供有效工具，確保產(chǎn)品標(biāo)簽的一致性，保護消費者的合法權(quán)益。

本發(fā)明的主要原理為：設(shè)計一組可以特異的識別蘿卜序列的兩個引物，通過普通PCR反應(yīng)在一小時內(nèi)該循環(huán)反應(yīng)可使靶DNA累積到10⁹～10¹⁰拷貝。擴增結(jié)果經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果判別。

本發(fā)明涉及的PCR擴增檢測用的蘿卜引物，其序列如下：

(1)上游引物：5’-TCACCTGGGCATTCTTTC-3’；

(2)下游引物：5’-CTGACTTCGTTCGTTAGAAG-3’；

在實際應(yīng)用中，上游引物、下游引物體積比為：1∶1。

使用上述引物，檢測可能含有蘿卜源性食品加工產(chǎn)品中蘿卜成分的方法，依次包括下列步驟(1)-(3)：

(1)待檢樣品DNA的提取

DNA提取可采用普通酚-氯仿提取法或使用相同提取方法的DNA提取試劑盒。

(2)PCR擴增

A.在擴增反應(yīng)管中加入在擴增反應(yīng)管中加入dNTP?2μL、10×Buffer?2.5μL；10μmol/L上游引物0.5μL、10μmol/L下游引物0.5μL、Taq酶0.5μL、待檢樣品DNA?2μL(約200ng)、ddH₂O(滅菌雙蒸水)補足至總體積25μl，混勻；

B.在普通PCR儀中進行PCR反應(yīng)35-40個循環(huán)，程序為：

94℃3min；(94℃30s；58℃30s；)×35-40cycles；

(3)結(jié)果檢測

通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增條帶，制備濃度1％的瓊脂糖凝膠，按比例混勻電泳上樣緩沖液和PCR擴增產(chǎn)物，然后將混有上樣緩沖液的PCR產(chǎn)物，加入樣品孔中，并用DL2000Marker分子質(zhì)量標(biāo)記，進行電泳分析。電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)的紫外投射光下觀察100bp處是否有擴增儲預(yù)期的特異性條帶拍攝并記錄。

附圖說明

用PCR技術(shù)檢測某待測含蘿卜樣品DNA，樣品的電泳圖譜。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明。

實施例

按照以下程序進行檢測：

(1)待測可能含蘿卜成分混合樣品DNA的提取

A.稱取0.1g樣品，轉(zhuǎn)至1.5mL離心管中。加入600μL預(yù)熱的裂解緩沖液，輕輕混勻后，65℃水浴保溫10min；

B.在管中加入等體積酚/氯仿600μL，上下顛倒充分混勻，抽提2min；

C.12000g離心5min，吸取上清到一新的離心管中，加入與上清等體積的沉淀液，混勻，常溫放置10min后，12000g離心5min，去上清，保留沉淀；

D.在沉淀中加入60μL?RNA酶，37℃放置2min后，用槍頭將其充分混勻，于37℃溶解沉淀，5min后加入300μL緩沖液，上下顛倒混勻10次；

E.取出離心柱，將離心柱放置在1個2mL的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置2min；