[發(fā)明專利]一種利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬傳染性胃腸炎病毒的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210141452.2
• 申請(qǐng)日: 2012-05-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102660510A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 于萍萍;王貴華;侯艷紅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司;福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N7/00
• 分類號(hào): C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬傳染性胃腸炎病毒的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)制備單層傳代細(xì)胞；

2)制備豬傳染性胃腸炎病毒生產(chǎn)用種毒；

3)將步驟1)制備的單層傳代細(xì)胞消化后，用細(xì)胞生長(zhǎng)液進(jìn)行懸浮，制備成細(xì)胞密度為1-3×10⁵個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種到生物反應(yīng)器內(nèi)，使傳代細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的微載體上吸附培養(yǎng)；

4)當(dāng)傳代細(xì)胞長(zhǎng)至微載體的80％-90％，空球率低于5％，滿球率大于80％，細(xì)胞計(jì)數(shù)達(dá)到3-5×10⁶個(gè)/mL以上時(shí)，以2-5％的接種量接種步驟2)制備的種毒，進(jìn)行病毒的吸附培養(yǎng)；

4)當(dāng)微載體上的傳代細(xì)胞80％以上病變時(shí)，收獲病毒液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括在步驟3)細(xì)胞懸液接種到生物反應(yīng)器之前，按生物反應(yīng)器總體積的50-70％加入無(wú)菌細(xì)胞生長(zhǎng)液，且每升無(wú)菌細(xì)胞生長(zhǎng)液中按4-10g/L濃度加入微載體，啟動(dòng)生物反應(yīng)器，低轉(zhuǎn)速攪拌20-50分鐘。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，還包括將微載體加入到細(xì)胞生長(zhǎng)液之前將微載體進(jìn)行清洗和滅菌的步驟，依次為用PBS浸泡微載體3小時(shí)以上；用PBS清洗微載體3-5遍；用PBS浸泡微載體，121℃蒸汽滅菌20-50min。

4.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟2)豬傳染性胃腸炎病毒生產(chǎn)用種毒的制備具體包括如下步驟：

用病毒培養(yǎng)液將豬傳染性胃腸炎病毒種毒按2-5％比例接種到單層傳代細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，至細(xì)胞80％以上病變時(shí)收獲病毒液；再將此病毒液作為種毒，在細(xì)胞上進(jìn)行細(xì)胞適應(yīng)性連續(xù)傳代復(fù)壯，每次傳代產(chǎn)物進(jìn)行病毒TCID₅₀和無(wú)菌檢測(cè)，傳至病毒TCID₅₀穩(wěn)定且達(dá)到10⁷TCID₅₀/mL以上時(shí)停止復(fù)壯，作為生產(chǎn)用種毒。

5.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟3)中的單層傳代細(xì)胞用EDTA-胰酶消化液進(jìn)行消化，所述的EDTA-胰酶消化液為含有質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.05％-0.25％的胰酶和0.02％的EDTA的Hank’S液。

6.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述的細(xì)胞生長(zhǎng)液的配方為：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95％-98％MEM液、2％-5％牛血清、終濃度為100-200IU/mL的抗菌素，pH值為6.8-7.5。

7.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的傳代細(xì)胞為ST細(xì)胞或vero細(xì)胞。

8.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，生物反應(yīng)器設(shè)定的參數(shù)為：培養(yǎng)溫度35-38℃、pH值6.8-7.5、溶氧50％-70％、攪拌速度50-80rpm。

9.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的豬傳染性胃腸炎病毒為浮羽疫苗株、h-5疫苗株或華毒株。

10.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的微載體為大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMA微載體、甲殼質(zhì)微載體、聚氨酯泡沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體、磁性微載體、Cytodex1、Cytodex?2、Cytodex?3，Cytopore和/或Cytoline。