[發明專利]三種菌的三重實時熒光PCR檢測引物、探針、檢測試劑盒和檢測方法

有效

• 申請號: 201210141228.3
• 申請日: 2012-05-08
• 公開（公告）號: CN102747144A
• 公開（公告）日: 2012-10-24
• 發明（設計）人: 許龍巖;袁慕云;曹際娟;柯碧霞;相大鵬;鄒志飛;謝力
• 申請（專利權）人: 許龍巖;袁慕云;曹際娟;柯碧霞;相大鵬;鄒志飛
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/42
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及重要的食源性致病菌沙門氏菌（Salmonella）、腸炎沙門氏菌（Salmonella?Enteritidis）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella?Typhimurium）的三重實時熒光PCR檢測引物、探針、檢測試劑盒和檢測方法。?

背景技術：

沙門氏菌（Salmonella）是重要的食源性致病菌之一，在世界各國細菌性食物中毒病例中，沙門氏菌引起的食物中毒案例常列榜首或第二位。沙門氏菌的血清型有2500多種，均有致病性，但宿主感染范圍可分為宿主適應血清型和非宿主適應血清型，前者包括馬流產沙門氏菌、羊流產沙門氏菌、雞沙門氏菌等，它們只能在相適應的宿主才有致病性，然而腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、鴨沙門氏菌、則能使多種宿主致病。英國的一項調查表明，腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌感染占到人類沙門氏菌感染病例的75％以上。食品中沙門氏菌的檢測主要是依靠傳統的培養的方法（可參見國標GBT4789.4-2010），該方法需經選擇性增菌培養，并通過生化反應及血清學測試來鑒定，操作復雜，費時費力，通常要5~6天才能得出檢測結果，不利于及時診斷病因，查找病源，控制病情的蔓延。隨著分子生物學的發展，已有針對沙門氏菌不同基因進行PCR擴增的報道，目前用作PCR試驗的引物主要有編碼抗原的基因和其它基因，rfbs基因（編碼D群和A群的O抗原），rfbj基因（編碼B群和C2群的O抗原），rbfE基因（編碼傷寒菌的O抗原）；ViaB基因（編碼Vi抗原）；fliC-a基因（編碼H：a抗原）；fliC-d基因（編碼H:d抗原）；毒力基因invA、spvC、invE等，但上述序列做目的?片段的普通PCR法或熒光PCR法，只能檢測到部分沙門氏菌血清型或其毒力基因。在腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的特異性基因檢測上，Wood等用腸炎沙門氏菌特異性血清型質粒的2Kb?Pst?I/BgⅢDNA片段作為靶序列建立PCR檢測方法，但許多腸炎沙門氏菌分離株無特異血清型質粒，該方法只能檢測特異血清型的腸炎沙門氏菌；Edel?O'Regan等用flic、sefa、sdf、acek為目的基因，用熒光PCR方法檢測沙門氏菌，但該方法無法準確區分鼠傷寒沙門氏菌、肯塔基沙門氏菌、都柏林沙門氏菌和雞沙門氏菌。?

發明內容：

本發明的目的是提供一種簡便、快速、可靠、靈敏度高、特異性強的沙門氏菌（Sa）、腸炎沙門氏菌（SE）、鼠傷寒沙門氏菌（ST）三重實時熒光PCR檢測引物、探針、檢測試劑盒和檢測方法，通過一次實時熒光PCR擴增就能判斷樣品是否受到沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌的污染。?

本發明根據沙門氏菌菌屬共有的aceA基因（GenBank:U43344.1）的保守區域、腸炎沙門氏菌特異序列（GenBank:AF370707.1）的保守區域、鼠傷寒沙門氏菌的STM4599序列（GenBank:AERV01000023.1）的保守區域，分別設計檢測引物和檢測探針，沙門氏菌的aceA基因用于檢測不同血清型沙門氏菌，腸炎沙門氏菌的特異序列用于檢測腸炎沙門氏菌，鼠傷寒沙門氏菌的STM4599序列用于特異性檢測鼠傷寒沙門氏菌，利用基于Taqman探針的三重實時熒光PCR方法，通過一次實時熒光PCR擴增來判斷樣品中是否受到沙門氏菌、腸炎沙門氏菌及鼠傷寒沙門氏菌的污染，達到簡便、快速、可靠、靈敏度高和特異性強的目的，從而實現了本發明的目的。?

本發明的沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌三重實時熒光PCR檢測引物，其特?征在于，所述的檢測引物如下所示：?

針對aceA基因：?

5`-TCACCGAAAGACCAACAGAAG-3`；（如SEQ?ID?NO.1所示）?

5`-GAACTCGCTGAAATGAGCAG-3`；（如SEQ?ID?NO.2所示）?

針對腸炎沙門氏菌特異序列：?

5`-CTCATTCTGACCTCTAAGCCG-3`；（如SEQ?ID?NO.3所示）?

5`-TCTGGTACTTACGATGACAACTTC-3`；（如SEQ?ID?NO.4所示）?

針對鼠傷寒沙門氏菌STM4599序列：?

5`-ATTTCTGGATATGGTACTGAGGC-3`；（如SEQ?ID?NO.5所示）?

5`-AAATGAGTTGCTTTACGCTGC-3`。（如SEQ?ID?NO.6所示）?