[發明專利]Ⅰ型人膠原蛋白和表皮生長因子雙表達載體及其表達純化方法

有效

• 申請號: 201210139088.6
• 申請日: 2012-05-07
• 公開（公告）號: CN102747097A
• 公開（公告）日: 2012-10-24
• 發明（設計）人: 高恩;侯增淼;李哲;趙真虎;趙金禮
• 申請（專利權）人: 陜西東大生化科技有限責任公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/66;C12P21/02;C07K14/78;C07K14/485;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18;C07K1/16;C12R1/84
• 代理公司: 西安永生專利代理有限責任公司 61201
• 代理人: 申忠才

1.一種Ⅰ型人膠原蛋白和表皮生長因子雙表達載體，其特征在于：插入的外源序列氮端為Ⅰ型人膠原蛋白的600個氨基酸，碳端為表皮生長因子的53個氨基酸，在Ⅰ型人膠原蛋白上游添加pPIC9K載體自身α信號肽切割位點和用于連接載體的亮氨酸和谷氨酸，在表皮生長因子上游添加pPIC9K載體自身α信號肽切割位點以及用于連接Ⅰ型人膠原蛋白的谷氨酸和苯丙氨酸，該Ⅰ型人膠原蛋白-表皮生長因子的氨基酸序列如下：

1????????LEKREAGVAG?PKGPAGERGS?PGPAGPKGSP?GEAGRPGEAG?LPGAKGLTGS?PGSPGPDGKT

61???????GPPGPAGQDG?RPGPPGPPGA?RGQAGVMGFP?GPKGAAGEPG?KAGERGVPGP?PGAVGPAGKD

121??????GEAGAQGPPG?PAGPAGERGE?QGPAGSPGFQ?GLPGPAGPPG?EAGKPGEQGV?PGDLGAPGPS

181??????GARGERGFPG?ERGVQGPPGP?AGPRGANGAP?GNDGAKGDAG?APGAPGSQGA?PGLQGMPGER

241??????GAAGLPGPKG?DRGDAGPKGA?DGSPGKDGVR?GLTGPIGPPG?PAGAPGDKGE?SGPSGPAGPT

301??????GARGAPGDRG?EPGPPGPAGF?AGPPGADGQP?GAKGEPGDAG?AKGDAGPPGP?AGPAGPPGPI

361??????GNVGAPGAKG?ARGSAGPPGA?TGFPGAAGRV?GPPGPSGNAG?PPGPPGPAGK?EGGKGPRGET

421??????GPAGRPGEVG?PPGPPGPAGE?KGSPGADGPA?GAPGTPGPQG?IAGQRGVVGL?PGQRGERGFP

481??????GLPGPSGEPG?KQGPSGASGE?RGPPGPMGPP?GLAGPPGESG?REGAPGAEGS?PGRDGSPGAK

541??????GDRGETGPAG?PPGAPGAPGA?PGPVGPAGKS?GDRGETGPAG?PAGPVGPVGA?RGPAGPQGPR

601??????GDKGETEFKR?EANSDSECPL?SHDGYCLHDG?VCMYIEALDK?YACNCVVGYI?GERCQYRDLK

661??????WWELR

2.根據權利要求1所述的Ⅰ型人膠原蛋白和表皮生長因子雙表達載體，其特征在于：所述的pPIC9K載體自身α信號肽切割位點氨基酸序列為Lys-Arg-Glu-Ala。

3.根據權利要求1所述的Ⅰ型人膠原蛋白和表皮生長因子雙表達載體，其特征在于：所述的表皮生長因子的核苷酸序列為：

1???????AATTCTGATT?CTGAATGTCC?TTTGTCCCAC?GATGGTTACT?GCTTGCATGA?TGGTGTCTGC

61??????ATGTATATTG?AAGCATTGGA?TAAGTATGCT?TGTAACTGTG?TTGTTGGCTA?CATCGGTGAG

121?????AGATGTCAGT?ACAGAGACTT?GAAGTGGTGG?GAATTGAGAT?AA

4.一種權利要求1所述的Ⅰ型人膠原蛋白和表皮生長因子雙表達載體的表達純化方法，其特征在于它包括下述步驟：

（1）基因的獲得

從離體的人胎盤中提取總RNA，反轉錄獲得cDNA，設計Ⅰ型人膠原蛋白基因PCR擴增引物，引入限制性酶切位點Xho?Ⅰ、EcoR?Ⅰ和pPIC9K載體自身α信號肽切割位點序列AAACGAGAAGCT，引物序列為：

F:?CGCTCGAGAAACGAGAAGCTGGTGTTGCTGGTCCCA

R:?CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG

采用PCR方法擴增獲得Ⅰ型人膠原蛋白基因；

重新設計并合成表皮生長因子的核苷酸序列，添加限制性內切酶酶切位點EcoR?Ⅰ及Not?Ⅰ和?pPIC9K載體自身α信號肽切割位點序列AAACGAGAAGCT，表皮生長因子的核苷酸序列如下：

1????????GAATTCAAAC?GAGAAGCTAA?TTCTGATTCT?GAATGTCCTT?TGTCCCACGA?TGGTTACTGC

61???????TTGCATGATG?GTGTCTGCAT?GTATATTGAA?GCATTGGATA?AGTATGCTTG?TAACTGTGTT

121??????GTTGGCTACA?TCGGTGAGAG?ATGTCAGTAC?AGAGACTTGA?AGTGGTGGGA?ATTGAGATAA

181??????GCGGCCGC

（2）載體pPIC9K與Ⅰ型人膠原蛋白、表皮生長因子的連接

對pPIC9K及Ⅰ型人膠原蛋白進行XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切，回收酶切產物，用DNA連接酶連接，并轉化大腸桿菌，提取質粒，命名為pPIC9K-COL1；對pPIC9K-COL1質粒與表皮生長因子分別進行EcoRⅠ及NotⅠ雙酶切，回收酶切產物，用DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌，提取質粒，命名為pPIC9K-COL1-EGF；

該重組DNA序列如下：

1????????CTCGAGAAAC?GAGAAGCTGG?TGTTGCTGGT?CCCAAGGGTC?CCGCTGGTGA?ACGTGGTTCT

61???????CCTGGCCCTG?CTGGCCCCAA?AGGATCTCCT?GGTGAAGCTG?GTCGTCCCGG?TGAAGCTGGT

121??????CTGCCTGGTG?CCAAGGGTCT?GACTGGAAGC?CCTGGCAGCC?CTGGTCCTGA?TGGCAAAACT

181??????GGCCCCCCTG?GTCCCGCCGG?TCAAGATGGT?CGCCCCGGAC?CCCCAGGCCC?ACCTGGTGCC

241??????CGTGGTCAGG?CTGGTGTGAT?GGGATTCCCT?GGACCTAAAG?GTGCTGCTGG?AGAGCCCGGC

301??????AAGGCTGGAG?AGCGAGGTGT?TCCCGGACCC?CCTGGCGCTG?TCGGTCCTGC?TGGCAAAGAT

361??????GGAGAGGCTG?GAGCTCAGGG?ACCCCCTGGC?CCTGCTGGTC?CCGCTGGCGA?GAGAGGTGAA

421??????CAAGGCCCTG?CTGGCTCCCC?CGGATTCCAG?GGTCTCCCTG?GTCCTGCTGG?TCCTCCAGGT

481??????GAAGCAGGCA?AACCTGGTGA?ACAGGGTGTT?CCTGGAGACC?TTGGCGCCCC?TGGCCCCTCT

541??????GGAGCAAGAG?GCGAGAGAGG?TTTCCCTGGC?GAGCGTGGTG?TGCAAGGTCC?CCCTGGTCCT

601??????GCTGGTCCCC?GAGGGGCCAA?CGGTGCTCCC?GGCAACGATG?GTGCTAAGGG?TGATGCTGGT

661??????GCCCCTGGAG?CTCCCGGTAG?CCAGGGCGCC?CCTGGCCTTC?AGGGAATGCC?TGGTGAACGT

721??????GGTGCAGCTG?GTCTTCCAGG?GCCTAAGGGT?GACAGAGGTG?ATGCTGGTCC?CAAAGGTGCT

781??????GATGGCTCTC?CTGGCAAAGA?TGGCGTCCGT?GGTCTGACTG?GCCCCATTGG?TCCTCCTGGC

841??????CCTGCTGGTG?CCCCTGGTGA?CAAGGGTGAA?AGTGGTCCCA?GCGGCCCTGC?TGGTCCCACT

901??????GGAGCTCGTG?GTGCCCCCGG?AGACCGTGGT?GAGCCTGGTC?CCCCCGGCCC?TGCTGGCTTT

961??????GCTGGCCCCC?CTGGTGCTGA?CGGCCAACCT?GGTGCTAAAG?GCGAACCTGG?TGATGCTGGT

1021?????GCTAAAGGCG?ATGCTGGTCC?CCCTGGCCCT?GCCGGACCCG?CTGGACCCCC?TGGCCCCATT

1081?????GGTAATGTTG?GTGCTCCTGG?AGCCAAAGGT?GCTCGCGGCA?GCGCTGGTCC?CCCTGGTGCT

1141?????ACTGGTTTCC?CTGGTGCTGC?TGGCCGAGTC?GGTCCTCCTG?GCCCCTCTGG?AAATGCTGGA

1201?????CCCCCTGGCC?CTCCTGGTCC?TGCTGGCAAA?GAAGGCGGCA?AAGGTCCCCG?TGGTGAGACT

1261?????GGCCCTGCTG?GACGTCCTGG?TGAAGTTGGT?CCCCCTGGTC?CCCCTGGCCC?TGCTGGCGAG

1321?????AAAGGATCCC?CTGGTGCTGA?TGGTCCTGCT?GGTGCTCCTG?GTACTCCCGG?GCCTCAAGGT

1381?????ATTGCTGGAC?AGCGTGGTGT?GGTCGGCCTG?CCTGGTCAGA?GAGGAGAGAG?AGGCTTCCCT

1441?????GGTCTTCCTG?GCCCCTCTGG?TGAACCTGGC?AAACAAGGTC?CCTCTGGAGC?AAGTGGTGAA

1501?????CGTGGTCCCC?CTGGTCCCAT?GGGCCCCCCT?GGATTGGCTG?GACCCCCTGG?TGAATCTGGA

1561?????CGTGAGGGGG?CTCCTGGTGC?CGAAGGTTCC?CCTGGACGAG?ACGGTTCTCC?TGGCGCCAAG

1621?????GGTGACCGTG?GTGAGACCGG?CCCCGCTGGA?CCCCCTGGTG?CTCCTGGTGC?TCCTGGTGCC

1681?????CCTGGCCCCG?TTGGCCCTGC?TGGCAAGAGT?GGTGATCGTG?GTGAGACTGG?TCCTGCTGGT

1741?????CCCGCCGGTC?CTGTCGGCCC?TGTTGGCGCC?CGTGGCCCCG?CCGGACCCCA?AGGCCCCCGT

1801?????GGTGACAAGG?GTGAGACAGA?ATTCAAACGA?GAAGCTAATT?CTGATTCTGA?ATGTCCTTTG

1861?????TCCCACGATG?GTTACTGCTT?GCATGATGGT?GTCTGCATGT?ATATTGAAGC?ATTGGATAAG

1921?????TATGCTTGTA?ACTGTGTTGT?TGGCTACATC?GGTGAGAGAT?GTCAGTACAG?AGACTTGAAG

1981?????TGGTGGGAAT?TGAGATAAGC?GGCCGC

（3）畢赤酵母電轉化

將10μg經Sal?Ⅰ內切酶線性化的pPIC9K-COL1-EGF質粒，與80μL畢赤酵母感受態細胞混勻，轉至0.2cm冰預冷的電轉化杯中，電擊4～10毫秒，加入1mL冰預冷的1mol/L的山梨醇溶液將菌體混勻，涂布MD培養基平板，30?℃倒置培養2～3天，在MD培養基平板上長出菌落；

（4）多拷貝插入重組子的篩選

將MD培養基平板上長出的菌落用無菌牙簽對應接種到G418濃度分別為0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，30℃培養，篩選獲得轉化子；

（5）Ⅰ型人膠原蛋白-表皮生長因子的發酵表達

將篩選到的轉化子接種于400ml?BMGY培養基中，30?℃振蕩培養24小時，作為一級種子轉接于裝有4L?FBS培養基的5L發酵罐中，溫度設定為30?℃，pH?值為5.0，培養16～20小時，作為二級種子轉接入裝有FBS培養基的150L大罐發酵，生長溫度30℃，誘導溫度29℃，pH?值為5.5，溶氧控制在20%～30%，流加質量濃度為75%的含12?mL/L?PTM1?微量元素的甲醇水溶液，FBS培養基與質量濃度為75%的含12?mL/L?PTM1?微量元素的甲醇水溶液的體積比為1:0.25，誘導發酵36～42小時，在發酵分泌表達出胞外的過程中，切割α信號肽切割位點，切割出Ⅰ型人膠原蛋白、表皮生長因子兩種蛋白；

（6）Ⅰ型人膠原蛋白和表皮生長因子的純化

發酵結束后，發酵液離心分離，取上清液，用孔徑為0.1μm中空纖維微濾系統進行微濾，收集濾過液，用分子量為1000D的卷式超濾膜超濾，收集濃縮液，獲得表皮生長因子與Ⅰ型人膠原蛋白混合濃縮液，用分子篩層析分離，分別收集表皮生長因子與Ⅰ型人膠原蛋白，獲得表皮生長因子粗蛋白液及Ⅰ型人膠原蛋白粗蛋白液；表皮生長因子粗蛋白液用陰離子交換層析，獲得表皮生長因子；Ⅰ型人膠原蛋白粗蛋白液，用陽離子交換層析，獲得Ⅰ型人膠原蛋白。