[發明專利]一株豬圓環病毒2型毒株及其應用

有效

• 申請號: 201210139084.8
• 申請日: 2012-05-08
• 公開（公告）號: CN102732486A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 李俊;王金寶;時建立;徐紹建;吳家強
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;A61K39/12;A61P31/20;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于微生物動物疫苗領域，尤其涉及一株豬圓環病毒2型毒株及其相關應用。?

背景技術

豬圓環病毒為無囊膜單股環狀DNA病毒，病毒粒子直徑為17-20nm，呈20面體對稱。在國際病毒學分類中，已將豬圓環病毒、雞貧血病毒及鸚鵡喙羽病毒分為一個新科，即圓環病毒科。該病毒現有兩個基因型PCV1和PCV2，基因組含有2個主要閱讀框架，其中ORF1基因編碼產物與病毒復制酶相關(Rep)，ORF2基因編碼產物是構成病毒衣殼蛋白(Cap)成分。PCV1是由Tischer等1974年首次在PK-15細胞培養物中發現，對豬無致病性。豬圓環病毒2型(porcine?circovirus?type2，PCV2)可引起斷奶后仔豬多系統衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎腎病綜合征(PDNS)、繁殖障礙等相關疾病，其中以PMWS最為嚴重，PMWS于1991年首次在加拿大發現，其病原為PCV2感染引起。該病主要侵害6～12周齡仔豬，引起漸進性消瘦、呼吸困難、腹瀉和黃疽等，給世界養豬業造成了巨大的經濟損失。?

國內自2001年報道該病以來，在各省市均有不同程度的流行。為此本研究在對臨床樣品進行PCV2檢測的基礎上，將檢測為陽性的病例進行了病毒分離，由于PCV2體外培養不產生細胞病變，病毒增殖能力差，給研究工作帶來一定困難。為了深入研究PCV2在體外細胞培養增殖的特性，本研究從臨床PMWS病料分離PCV2毒株，經細胞連續傳代，獲得一株細胞培育適應毒，經聚合酶鏈式反應(PCR)、間接免疫熒光實驗、透射電鏡及核酸序列分析等方法鑒定、證實分離株為PCV2。為下一步深入開展PCV2相關研究提供了一定的物質材料與理論基礎。?

附圖說明

圖1PCV2SD病毒PCR擴增產物：1.DNA標準DL?2000；2-5病毒培養物PCR產物；6陽性對照7.陰性對照?

圖2IFA法檢測PCV2?SD感染PK-15細胞結果：圖A為感染細胞，圖B為未感染細胞對照。?

圖3電鏡下觀察到的PCV2?SD粒子照片：(140,000×)標尺＝50nm。?

發明內容

本發明通過分離鑒定得到了一株豬圓環病毒2型毒株(PCV2)，并命名為PCV2?SD株，該毒株已于2012年2月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區屯路，中國科學院微生物研究所)，毒株保藏號：CGMCC?NO.5774，其分類命名為：豬圓環病毒2型。?

PCV2的檢測通常需要借助免疫熒光實驗等方法，應用病毒特異性抗體才能證實病毒在?細胞中復制。本研究采用IFA法檢測病毒感染細胞中的抗原。熒光顯微鏡下觀察，PCV2單克隆抗體孔可見致密的細胞核內熒光染色及稀疏的胞漿內熒光染色。PCV2在體外細胞培養不呈現細胞病變，病毒在細胞的增殖能力也較差。可能與該病毒復制的過程中過度依賴宿主細胞聚合酶有關，由于這種酶類主要在細胞繁殖S周期中合成，縮短了病毒的繁殖期，從而導致病毒增殖能力下降。D-氨基葡萄糖一方面可以增強細胞S期蛋白的表達，另一方面可以促進病毒DNA進人細胞核，從而增強病毒的繁殖復制，據報道可使PCV抗原陽性細胞數提高30％。據此，我們在細胞分瓶后12h，細胞處于對數生長期的時候用D-氨基葡萄糖處理，從而更有效地促進了PCV2的繁殖復制。但在用D-氨基葡萄糖處理細胞培養物時需注意控制時間，處理過程不宜過長，否則將產生毒害作用。?

PCV2感染已引起世界養豬業的巨大經濟損失，PCV2疫苗也在加緊研制。但由于PCV2在細胞上的培養滴度非常低，很多疫苗生產廠家基于成本太高，放棄了開發PCV2疫苗的打算，因此，如何提高PCV2在細胞上的滴度應該也是今后研究的工作重點之一。本研究所分離的PCV2?SD毒株，毒價比較高，經20代傳代之后為10^6.0TCID50/ml，有作為疫苗研究的價值。另外，不同毒株的毒價差異是否與其致病性有關還待進一步研究。分離毒株隨細胞傳代次數的遞增，病毒滴度也顯著升高，PCV2增殖能力除受宿主細胞合成外源聚合酶的影響外，也與體外細胞培養的適應性有關。病毒分離株通過體外細胞培養馴化，可以有效改變病毒與細胞表面受體的親和關系。?

PCV2可以在BALB/c小鼠和昆明小鼠復制并產生組織病變。據此，本研究采用昆明小鼠作為實驗動物，接種病毒培養物，剖檢發現60％接毒小鼠頜下淋巴結有明顯充血；PCR成功檢測到PCV2SD株在小鼠體內增殖。?