[發明專利]一種抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒增殖的microRNA及其應用

有效

• 申請號: 201210138973.2
• 申請日: 2012-05-07
• 公開（公告）號: CN102676519A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 楊利敏;陳才偉;牟身蕓;劉亭見;李晶
• 申請（專利權）人: 北京諾派生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/11;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;A61K48/00;A61P31/14
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)增殖的microRNA及其應用。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合癥（porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome，PRRS），又稱為豬藍耳病，是由PRRS病毒（PRRS?virus,PRRSV）引起的豬的一種高發傳染病，可引起母豬的繁殖障礙、各年齡豬發生呼吸道癥狀以及仔豬死亡，此外還可以導致免疫抑制從而誘發繼發感染，對全世界的養豬業都造成了巨大的經濟損失。該病在1987年首次發現于美國，而后迅速傳播到加拿大及歐洲各地，如今這種疾病已經傳播到世界各地。尤其是2006年下半年以來，我國25個省份爆發了由毒力變異的高致病性PRRSV毒株（H-PRRSV）為主要病原的“豬高熱病”（HP-PRRS），本病的傳染性極強，一旦感染，會引起妊娠母豬早產、流產、死胎、弱胎和木乃伊胎，導致公豬種用性能下降，加劇病情，死亡率升高，給我國的養豬業造成嚴重的經濟損失。

PRRSV屬于動脈炎病毒科動脈炎病毒屬，根據病毒抗原的抗原性、基因組及致病性差異，PRRSV可分為2個型，即歐洲型（I型，以LV株為代表）和美洲型（II型，以VR2332株為代表）。目前在我國流行的主要是II型毒株。該病毒的基因組大約長15.4k?bp,含有至少10個開放閱讀框:ORF1a/1b,ORF2a/2b,ORF3-4,ORF5/5a,ORF6-7，分別編碼病毒的非結構蛋白nsp1-14，Gp2a/E，Gp3，Gp4，Gp5/Gp5a，M和N蛋白。

疫苗接種是當前預防PRRS的最普遍方法，國內外已有商業化的PRRS疫苗，包括弱毒疫苗和滅活疫苗。但是，弱毒疫苗在提供免疫保護的同時，還會持續散播疫苗病毒，使得病毒在豬場中循環存在，可能發生重組變異等，存在著毒力返強等不安全性問題，有時甚至引發PRRS爆發。而滅活疫苗存在著免疫劑量大、免疫次數多、免疫產生周期長，不能對非疫苗株型的病毒侵染提供免疫保護等缺點，不太適合仔豬免疫，而仔豬帶毒是豬場PRRSV持續存在的重要原因。所以，研發有效抑制PRRSV感染的方法就顯得尤為重要。

microRNAs（miRNA）是一種大小約21-23個堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發夾結構的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體(pre-miRNA)經過Dicer酶加工后生成。它通過與其目標mRNA分子的3'端非編碼區域(3'UTR)互補匹配導致該mRNA分子的翻譯受到抑制，通過抑制靶基因的翻譯過程或促使靶基因的mRNA降解。miRNA的合成和作用機制如下：在細胞核內編碼miRNA的基因轉錄成pri-microRNA(pri-miRNA)。pri-miRNA在一種Drosha?RNase的作用下，剪切為約70個核苷酸長度，具有莖環結構的miRNA前體(pre-miRNA)。pre-miRNA在Ran-GTP依賴的核質/細胞質轉運蛋白Exportin?5的作用下，從核內運輸到胞質中。在Dicer酶(雙鏈RNA專一性RNA內切酶)的作用下，miRNA前體被剪切成21-25個核苷酸長度的雙鏈miRNA。起初，成熟miRNA與其互補序列互相結合成所謂miRNA:miRNA*雙螺旋結構(miRNA*是miRNA的反向互補序列)；隨后，雙螺旋解旋，其中一條結合到RNA誘導的基因沉默復合物(RNA-induced?silencing?complex，RISC)中，形成非對稱RISC復合物(asymmetric?RISC?assembly)，該復合物會結合到目標靶mRNA上。在大多數情況下(例如在動物中)，復合物中的單鏈miRNA與靶mRNA的3'UTR不完全互補配對，從而阻斷該基因的翻譯過程。

發明內容

本發明的目的是提供一種抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)增殖的microRNA及其應用。

本發明提供的microRNA為序列表的序列1所示的單鏈RNA。

本發明還保護序列表的序列2所示的DNA分子（編碼所述microRNA的DNA分子）。

含有所述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發明的保護范圍。