[發(fā)明專利]一種泥蚶血紅蛋白Tg-HbIIA及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210138736.6
• 申請日: 2012-05-06
• 公開（公告）號: CN102643342A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 包永波;林志華;董迎輝
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江萬里學(xué)院
• 主分類號: C07K14/805
• 分類號: C07K14/805;C12N15/12;C12N15/63;A23K1/16;A61K38/42;A61P31/04
• 代理公司: 青島海昊知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司 37201
• 代理人: 張中南;曾慶國

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于血紅蛋白及體外重組表達(dá)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種泥蚶血紅蛋白（Tg-HbIIA）及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

血紅蛋白（hemoglobin，Hb）是所有脊椎動物和部分無脊椎動物血液中所含有的一大類含鐵的呼吸蛋白，具有多重生物學(xué)功能，是最具有研究價(jià)值的蛋白質(zhì)家族之一。在無脊椎動物中具有血紅蛋白的比較少見，一個(gè)有趣的現(xiàn)象是以泥蚶為代表的蚶科貝類的血液中存在大量的血紅蛋白，而絕大多數(shù)貝類的攜氧蛋白是血藍(lán)蛋白，如鮑類、蛤類等（Lieb,?et?al,?Proc?Natl?Acad?Sci?U?S?A,?2001,?98:4546-4551）。早有研究者提出血藍(lán)蛋白比較原始，在演化過程中逐漸被血紅蛋白取代（Mangum,?et?al,?Biol?Bull,?1987,?173:205-221.）。研究表明貝類血藍(lán)蛋白和脊椎動物血紅蛋白不但具有攜氧的主要功能，而且還具有抗菌、抗病毒等免疫功能（Jiang,?et?al,?Nat?Immunol.?2007,?8:1114-1122.）。研究發(fā)現(xiàn)泥蚶血紅蛋白在受到弧菌、LPS和PGN等致病因子刺激后，表達(dá)量會急劇上升，表明泥蚶血紅蛋白基因參與了抗菌免疫反應(yīng)。

隨著重組DNA技術(shù)和其他現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，不斷有新的功能基因被發(fā)現(xiàn)、克隆和表達(dá)，人們開創(chuàng)了用基因重組技術(shù)體外生產(chǎn)蛋白質(zhì)的新紀(jì)元。在已有的重組蛋白表達(dá)體系中，大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)因其操作方便、價(jià)格低廉、高效表達(dá)和穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)成為重組蛋白質(zhì)的首選表達(dá)系統(tǒng)。血紅蛋白體外表達(dá)的研究僅限于人、豬等大動物，在人血紅蛋白體外表達(dá)的研究中，已經(jīng)通過大腸桿菌、真菌實(shí)現(xiàn)了體外表達(dá)，顯示在真菌中表達(dá)量不如大腸桿菌高。關(guān)于無脊椎動物血紅蛋白的體外表達(dá)還未見報(bào)道，由于無脊椎動物與脊椎動物血紅蛋白氨基酸序列及蛋白結(jié)構(gòu)方面的差異，因此，構(gòu)建合適的表達(dá)載體，尋找簡便、高效的表達(dá)方法是貝類血紅蛋白表達(dá)現(xiàn)在面臨的問題。表達(dá)人血紅蛋白的目的是尋找天然血液的替代品，從而解決用血緊張的局面，而在貝類等水產(chǎn)動物的研究中，我們的目的是篩選大量表達(dá)且具有活性的抗菌血紅蛋白工程菌株，繼而生產(chǎn)大量高效、低毒、無污染的抗菌蛋白產(chǎn)品，作為飼料免疫添加劑或生產(chǎn)免疫蛋白制劑用于貝類育苗和健康養(yǎng)殖。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種來自于泥蚶的血紅蛋白（Tg-HbIIA），并可將克隆的泥蚶血紅蛋白基因通過大腸桿菌體外表達(dá)，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明提供一種泥蚶血紅蛋白Tg-HbIIA，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1；

本發(fā)明還提供一種核苷酸，用于編碼上述的血紅蛋白（Tg-HbIIA），所述的核苷酸的序列為SEQ?ID?NO：2。

本發(fā)明還提供用于表達(dá)上述的血紅蛋白（Tg-HbIIA）的重組質(zhì)粒。

本發(fā)明的泥蚶血紅蛋白Tg-HbIIA用于制備免疫增強(qiáng)劑，例如作為飼料添加劑和細(xì)菌性疾病疫苗。

本發(fā)明表達(dá)的泥蚶血紅蛋白基因HbIIA融合蛋白具有廣譜的殺菌活力，特別是對水產(chǎn)動物致病菌弧菌類有較強(qiáng)的殺菌效果，這為研制新型的具有抗微生物活性的藥物和在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)上作為替代抗菌素的新型病害預(yù)防治療制劑奠定了基礎(chǔ)。與傳統(tǒng)從天然資源提取血紅蛋白的方法相比。本發(fā)明的制備方法血紅蛋白大批量、無毒性，使低成本的規(guī)模化生產(chǎn)成為可能，為海洋養(yǎng)殖貝類飼料添加劑和細(xì)菌性疾病疫苗的研制提供了一種新的途徑。

附圖說明

圖1：本發(fā)明的泥蚶血紅蛋白Tg-HbIIA的電泳圖，

其中：1泳道：純化的重組Tg-HbIIA的SDS-PAGE電泳圖，

2泳道：用His抗體鑒定Tg-HbIIA的Western?Blotting結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

1.泥蚶血細(xì)胞RNA的提取和反轉(zhuǎn)

取鮮活的泥蚶，用針管抽取泥蚶血竇中的血液，取1ml血液放入離心管中，3500轉(zhuǎn)/秒離心一分鐘，去上清，保留血細(xì)胞，用Trizol試劑抽提RNA。用紫外分光光度計(jì)檢測A280、A260的相對吸收值，同時(shí)采用電泳檢查RNA完整性。用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒反轉(zhuǎn)RNA，得到cDNA第一條鏈。

2.泥蚶血紅蛋白基因（Tg-Hb）含ORF的cDNA的亞克隆和驗(yàn)證

依據(jù)Tg-Hb基因成熟肽cDNA序列設(shè)計(jì)引物

HbIIA-ORF-F1?????5'??GCAAACGAGAAGAACTAAAGCAAC??3'

HbIIA-ORF-R1?????5'??CCATTGATGGTTGGTCCAGATA??3'