[發(fā)明專利]鼠尾藻凝集素及制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210137779.2
• 申請(qǐng)日: 2012-05-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102690339A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-09-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李丹彤;周曉茹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 大連海洋大學(xué);李丹彤
• 主分類號(hào): C07K14/405
• 分類號(hào): C07K14/405;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/18;C07K1/16
• 代理公司: 大連非凡專利事務(wù)所 21220
• 代理人: 閃紅霞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種凝集素及制備方法，尤其是一種凝集細(xì)胞廣泛的鼠尾藻凝集素及制備方法。

背景技術(shù)

凝集素（Lectin）是非免疫起源的具有糖專一性、可促使細(xì)胞凝集的蛋白質(zhì)或糖蛋白。凝集素在自然界中分布極廣，從病毒到人類，幾乎所有的物種中，均已分離得到了凝集素，其中最初發(fā)現(xiàn)的是植物凝集素。1966年，Boyd等人在一些熱帶海藻中發(fā)現(xiàn)了海藻凝集素的存在，此后Blunden和Rogers等對(duì)英國(guó)沿海的海藻檢測(cè)了提取物的凝集活性，但是發(fā)現(xiàn)只有很少的一些海藻提取物對(duì)未經(jīng)處理的人血紅細(xì)胞有一定的凝集作用，之后Hori等又對(duì)越南海藻凝集素進(jìn)行了篩選。Hori報(bào)道：至1994年，人們從10種綠藻、13種紅藻中分離純化出凝集素，并且從其中5種紅藻中得到了部分純化制品。之后，人們又對(duì)隅江蘺（Gracilaria?cornea）、絨線藻(Dasya?villosa?)?等進(jìn)行了分離純化及其性質(zhì)的研究，發(fā)現(xiàn)所提取的凝集素具有凝集細(xì)胞、參與原生質(zhì)體形成、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、激活淋巴細(xì)胞、抑制血小板凝集等多種功能的生物活性。褐藻雖然也是一種海藻，但是由于常規(guī)提取物中含有多酚，故人們一直偏見(jiàn)地認(rèn)為褐藻提取物凝集細(xì)胞現(xiàn)象只是多酚凝集血細(xì)胞的一種假凝集現(xiàn)象，以至于迄今為止，對(duì)海藻凝集素的研究主要集中在紅藻、綠藻，而關(guān)于褐藻門圓子綱馬尾藻屬鼠尾藻（Sargassum?thunbergii?O’Kuntze）凝集素的分離純化未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)偏見(jiàn)，提供一種凝集細(xì)胞廣泛的鼠尾藻凝集素及制備方法。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：一種鼠尾藻凝集素，其特征在于是以鼠尾藻為原料，經(jīng)凍干、粉碎、浸泡、離心、硫酸銨分級(jí)，DEAE-52離子交換層析和Sephadex?G-200凝膠過(guò)濾層析而得到，其分子量為17kD。

上述的鼠尾藻凝集素的制備方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行：

a.?以新鮮鼠尾藻為原料，凍干、粉碎成粗粉，按質(zhì)量體積（g/ml）比為1：10~20向鼠尾藻粗粉中添加含0.15mol.L^-1NaCl的PBS緩沖液，4℃~30℃浸泡16~24h，5000r/min離心30min，取上清液；

b.?在冰水浴及攪拌條件下，添加硫酸銨粉末至上清液中，使上清液中硫酸銨飽和度達(dá)65~85％，攪拌混勻后，5000r/min離心30min，收集沉淀，棄去上清；

c.?用生理鹽水溶解沉淀并用生理鹽水透析至無(wú)SO₄^2-后，采用1.6×20cm?DEAE-52纖維素離子交換層析柱，用梯度混合儀進(jìn)行線性梯度洗脫，所述梯度混合儀混合瓶中的洗脫液Ⅰ是pH?7.5的0.01mol.L^-1Tris-HCl緩沖液，所述梯度混合儀儲(chǔ)藏瓶的梯度洗脫液Ⅱ是pH?7.5含有0.8mol.L^-1?NaCl的0.15mol.L^-1?Tris-HCl緩沖液，洗脫流速為3ml/10min，按每管3ml分管，收集23~31管的洗脫產(chǎn)物并濃縮；

d.?將上述濃縮的洗脫產(chǎn)物，上1.6×90cm?Sephadex?G-200凝膠過(guò)濾層析柱，洗脫液為pH7.2的0.015mol/LPBS緩沖液，流速2ml/10min，按每管2ml分管，收集第51~59管的洗脫產(chǎn)物，冷凍干燥。

本發(fā)明首次以鼠尾藻為原料，分離、純化出凝集細(xì)胞活性強(qiáng)的鼠尾藻凝集素，所凝集的細(xì)胞廣泛，對(duì)于兔、狗、羊、鯽魚(yú)、雞及人（A、B、AB）等紅細(xì)胞均有凝集作用，其中對(duì)兔及雞紅細(xì)胞凝集反應(yīng)的最低濃度分別為4.4mg/ml、0.55?mg/ml，即使在100℃?30min熱處理后仍然對(duì)兔紅細(xì)胞顯示出血凝活性（活性下降75%），而在25℃～50℃保溫30min，活性均未見(jiàn)改變。糖抑制性實(shí)驗(yàn)表明，鼠尾藻凝集素僅被糖蛋白牛甲狀腺球蛋白和γ-球蛋白所抑制，最小抑制濃度分別為1.25mg.mL^-1和2.5mg.mL^-1。本發(fā)明的鼠尾藻凝集素在pH6.5～7范圍內(nèi)活性最高。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例經(jīng)凝膠過(guò)濾所測(cè)分子量譜圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例DEAE-52纖維素離子交換層析的譜圖。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例Sephadex?G-200凝膠過(guò)濾層析譜圖。

具體實(shí)施方式