[發明專利]檢測綿羊無漿體的試劑盒

有效

• 申請號: 201210137237.5
• 申請日: 2012-05-04
• 公開（公告）號: CN102634597A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: 殷宏;遲慶安;劉志杰;羅建勛;馬米玲;楊吉飛;李有全
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;G01N21/64
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司 62102
• 代理人: 張晉

技術領域

本發明涉及一種用于檢測動物血液病原菌的試劑盒。確切講本發明涉及一種用于檢測綿羊無漿體的試劑盒。

背景技術

綿羊無漿體(Anaplasma?ovis)是立克次體目(Rickettsiales)、無漿體科(Anaplasmataceac)中的無漿體屬(Anaplasma)的一個重要成員，Schellase等人于1912年首先報道在東非發現了綿羊無漿體，綿羊無漿體有廣泛的宿主，已經證明它能寄生于綿羊、山羊、馬鹿、白尾鹿、羚羊和大角羊等反芻動物的體內，綿羊無漿體經節肢動物-蜱傳播后寄生于宿主動物的紅細胞內，引起以發熱、貧血、黃疸、衰弱和漸進性消瘦為特征的一類血液細菌疾病，即羊無漿體病，急性發病時也可造成動物死亡。該病在世界各地廣泛流行，在我國許多地區也時有發生，尤其是在某些牧區，嚴重阻礙了畜牧業的發展。因此，建立快速、靈敏、準確又操作方便的檢測方法十分必要。

目前常用的診斷方法為血涂片染色法，但在感染率很低或在感染早期時很難在顯微鏡下檢查出病原，而且操作熟練程度將直接影響診斷結果的準確性。還有很多血清學方法，但都存在一定的假陽性或假陰性以及交叉反應。分子生物學診斷方法有套式PCR檢測方法，參見：李樹清，王貴強，陳志飛等，利用套式PCR檢測牛羊乏質體，畜牧獸醫學報，2011.42(12)：1768-1775，但套式PCR檢測過程中容易造成環境污染。

發明內容

本發明提供一種檢測綿羊無漿體的試劑盒，應用這種檢測試劑盒進行檢測可克服現有技術不足。

本發明的檢測綿羊無漿體的試劑盒內至少有如下的三條引物探針序列：正向引物SEQ№1，反向引物SEQ№2和探針SEQ№3，其中的探針序列的5端結合有熒光發光基團FAM，3端結合有熒光猝滅基團BHQ1。

為方便使用，在本發明的檢測綿羊無漿體的試劑盒中還包括有如下成分：熒光定量PCR反應液、標準陽性質粒模板pGEM-Teasy-gltA、陰性質控標準品。其中的熒光定量PCR反應液可以是由Premix?Ex?Taq^TM(2×)12.5μL，10μM的正向引物SEQ№1和10μM的反向引物SEQ№2各0.5μL，熒光探針溶液(5μM)1.0μL，ROX?Reference?Dye?Ⅱ(50×)0.5μL，滅菌蒸餾水8.0μL組成。另外，本發明檢測綿羊無漿體的試劑盒中的標準陽性質粒模板pGEM-Teasy-gltA為由正向引物SEQ№4和反向引物SEQ№5擴增的DNA片段構建的pGEM-Teasy重組質粒；而陰性質控標準品可以是滅菌蒸餾水。

本發明實際上是一種利用gltA基因檢測綿羊無漿體的實時熒光定量PCR方法。實時熒光定量PCR(real-time?fluorescent?quantitative?polymerasechain?reaction，real-time?FQ-PCR)技術于1996年由美國Applied?Biosystems公司推出，由于該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR技術相比它所具有的特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、自動化程度高、速度快、全封閉反應等優點，使其很快成為科研、臨床診斷的熱點技術。目前，國內外均未有檢測綿羊無漿體實時熒光定量PCR方法的報道，本發明利用綿羊無漿體gltA基因作為實時熒光定量PCR檢測靶基因，設計針對綿羊無漿體gltA基因的特異性引物和探針，從而提供了一種快速、靈敏、準確又操作方便的檢測綿羊無漿體的方法，填補了技術空白。本發明中，通過對實時熒光定量PCR反應條條件的優化，使本發明具有良好的敏感性、特異性、重復性，其敏感性比常規PCR高100倍，可以用于綿羊無漿體的快速定量檢測。

附圖說明

圖1實時熒光定量PCR擴增動力學曲線。

圖2實時熒光定量PCR標準曲線。

圖3實時熒光定量PCR靈敏度試驗。

圖4普通PCR檢測方法電泳圖。

其中M為DNA分子量標準DL2000；1、2、3、4、5、6、7、8分別為1.0×10⁷-1.0×10⁰拷貝/μL的質粒標準品；9為陽性對照；10為正常羊全血基因組；11為空白對照。

圖5實時熒光定量PCR特異性試驗。

圖6實時熒光定量PCR批內重復性試驗。

圖7實時熒光定量PCR批間重復性試驗。

具體實施方式

本發明以下結合附圖和實施例作詳細說明。