[發明專利]肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的特異性檢測用引物探針組合和試劑盒

有效

• 申請號: 201210137067.0
• 申請日: 2012-05-07
• 公開（公告）號: CN102660645A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發明（設計）人: 文鋒;其他發明人請求不公開姓名
• 申請（專利權）人: 鎮江和創生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14;C12Q1/04;C12N15/11;G01N21/64
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技術領域

本發明涉及一種采用熒光PCR技術，特異性檢測樣品中肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌核酸存在的寡核苷酸序列組合，以及包括該組合的試劑盒。?

技術背景

細菌性肺炎的病原體因宿主年齡、伴隨疾病與免疫功能狀態有較大差異。就獲得方式而言，社區獲得性肺炎病原體中常見的為肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌。?

肺炎鏈球菌是革蘭陽性球菌，是引起細菌性肺炎的最主要病原體，約占其2/3左右，全年均可發病，冬春季高發。流感嗜血桿菌是革蘭陰性小桿菌，在4-18月齡的兒童中高發，可以引起細菌性肺炎和細菌性腦膜炎。根據WTO統計數據，每年有超過30萬人死于流感嗜血桿菌引起的肺炎和腦膜炎。肺炎鏈球菌的實驗室診斷主要依靠病原菌培養。傳統的檢測法需要培養分離出菌株之后才能鑒定，需要時間較長。且流感嗜血桿菌生長條件苛刻，營養要求很高，費時費力，不利于快速檢測，并對于操作人員來說具備一定的危險性。近年來針對病原體的PCR反應快速檢測技術開始出現。對于PCR檢測來說，引物的選擇至關重要，直接影響檢測的特異性。如果引物特異性不夠，則可能導致檢測的假陽性結果或者假陰性結果的出現。?

對于肺炎患者呼吸道分泌物中肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的檢測是查明病因的重要步驟，對于臨床診斷和治療藥物選擇具有重要意義。?

本發明針對肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌特異的靶序列設計引物和?Taqman探針，利用real-time?PCR的方法，用來鑒別檢測樣品中肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌核酸，可以快速獲得特異性檢測結果。?

發明內容

為了更加準確地檢測樣品肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌核酸存在，本發明提供一種特異性檢測樣品中肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的寡核苷酸序列組合和包含該組合的試劑盒，其特征在于序列組合或試劑盒的PCR反應液中用于核酸擴增的引物為：?

P1：5`-AGTCGTTCCAAGGTAACAAGT-3`，?

P2：5`-CACGCACCGACTACCTAAACC-3`，?

P3：5`-TGCAACTCCAGCTGCTAAAGTATT-3`，?

P4：5`-TCTTCACCGTAAGATACTGTGCC-3`。?

P1和P2為針對肺炎鏈球菌基因組特異性序列設計并經預實驗篩選出的特異性引物，P3和P4為針對流感嗜血桿菌基因組特異性序列設計并經預實驗篩選出的特異性引物。?

本發明的特征還在于，序列組合或試劑盒的PCR反應液中用于熒光信號監測的寡核苷酸探針為：?

Probe1：5`-X<sub>1</sub>-GATCAGATTGAAGCTGATAAAACGATACA-Y<sub>1</sub>-3`，?

Probe2：5`-X<sub>2</sub>-TAGGTCAACGTCGTGCAGATGCAGTT-Y<sub>2</sub>-3`。?

X₁和X₂為熒光報告基團，Y₁和Y₂為熒光淬滅基團。Probe1為針對肺炎鏈球菌基因組特異性序列設計并經預實驗篩選出的特異性探針，Probe2為針對流感嗜血桿菌基因組特異性序列設計并經預實驗篩選出的特異性探針。?

本發明的特征還在于，試劑盒包括PCR反應液、酶混合液、陰性質控品和陽性質控品。其中PCR反應液主要含有上述的引物和探針、反應緩沖液、Mg²⁺和dNTP等，酶混合液主要含有熱啟動Taq酶，陰性質控品為去離子水，陽性質控品為含有檢測靶序列的核酸。?

本發明的另一優選實施方案為：序列組合或試劑盒的PCR反應液中用于熒?光信號監測的寡核苷酸探針的熒光基團分，其中Probe1熒光報告基團X₁為Fam，熒光淬滅基團Y₁為Eclipse，Probe2熒光報告基團X₂為Hex，熒光淬滅基團Y₂為Eclipse。?

本發明的另一優選實施方案為：試劑盒的包含上述兩對特異性引物和兩條特異性探針，屬于實時熒光雙重PCR檢測，可在同一個反應體系中對肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌核酸進行檢測和鑒別。?

本發明的另一優選實施方案為：試劑盒的PCR反應循環參數為95℃，2min；進入循環階段：95℃變性10s，60℃退火延伸1min，共反應40個循環。?