[發明專利]一種抗小鵝瘟病毒轉移因子的制備方法

有效

• 申請號: 201210136306.0
• 申請日: 2012-05-04
• 公開（公告）號: CN102697811A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 吳紅云;郭俊清;徐進
• 申請（專利權）人: 鄭州后羿制藥有限公司
• 主分類號: A61K35/28
• 分類號: A61K35/28;A61K35/26;A61P37/04;A61P31/20
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

技術領域

本發明涉及一種抗小鵝瘟病毒轉移因子的制備方法，屬于免疫學領域。

背景技術

小鵝瘟是由小鵝瘟病毒（GPV）引起的雛鵝和雛番鴨一種急性或亞急性的敗血癥，小腸發生急性卡他性或纖維素壞死性炎癥，主要侵害4-20日齡雛鵝，傳染快、發病率與死亡率都高，給養殖業帶來重大損失。本病是1956年由我國方定一在揚州發現，1965年來，歐洲很多國家報道有本病的存在。

轉移因子（TF，Transfer?Factor）又稱傳輸因子，可以作為細胞免疫促進劑，是T淋巴細胞釋放的一種能夠轉移致敏信息的低分子量多肽-核苷酸復合物，這種物質將供體的某種特定的細胞免疫功能特異地轉移給受體正常的淋巴細胞，參與機體的免疫反應，提高受體的細胞免疫功能；同時促進B淋巴細胞分泌作用，能夠誘導免疫細胞釋放干擾素和白介素，從而增強受體的抵抗力，這種轉移因子是一種小分子生物活性物質，不含蛋白質、可溶性好，具有純度高，免疫活性強，作用時間長，療效良好，安全無毒副作用等優點。

發明內容

本發明提供了一種抗小鵝瘟轉移因子的制備方法，以制備天然純生物活性物質轉移因子抑制小鵝瘟病毒，保護正常機體細胞免受小鵝瘟病毒的感染，達到根本的預防目的。

為了實現以上目的，本發明所采用的技術方案是：一種抗小鵝瘟轉移因子的制備方法，將小鵝瘟病毒接種于鵝胚的尿囊腔中進行增殖，提取病毒制備抗原；然后將提取的病毒抗原免疫健康豬，再從被免疫豬的免疫器官中提取抗小鵝瘟病毒轉移因子，具體制備步驟如下：

1）小鵝瘟病毒抗原的制備：將小鵝瘟病毒接種于12-14日齡鵝胚的尿囊腔中進行增殖，35℃，培養3-5天，提取尿腔液和絨尿膜，研磨超聲波處理后，經6000-8000r/min離心，棄沉淀留上清液，得到病毒粗抗原；

2）純化抗原：將病毒粗抗原液加入到不連續梯度密度為20-60%的蔗糖離心管上，經過超速心處理，根據小鵝瘟病毒粒子的大小確定病毒帶所在離心管的位置，吸取病毒抗原，透析除去抗原中的蔗糖，得到純病毒抗原備用；

3）病毒抗原免疫豬：隨機選取健康的豬，按病毒抗原病毒滴度制定接種劑量，采用皮下多點注射接種方式，免疫3次，每次間隔一周，然后從宰殺豬中無菌取其脾臟、胸腺、淋巴組織，放置-20℃保存；

4）從被免疫豬中提取抗小鵝瘟病毒轉移因子：

①將所取的脾臟、胸腺、淋巴組織經過無菌去離子水清洗干凈，然后剔凈臟器表面的筋膜及脂肪組織，再用PH為6.8-7.2的PBS緩沖液清洗干凈；

②將洗干凈的組織剪成小塊之后放入到組織勻漿機中，再加入2-3倍預冷的0.85%生理鹽水，1500-2000r/min轉速，每次2?min，制得勻漿液；

③勻漿液經過-60_-?-80℃快速冷凍,再快速解凍，經過4-5次的凍融，然后將凍融后的溶液放到低溫超聲波細胞破碎儀中破碎3s停3s，經過20min破碎，得到精細的勻漿液，再加3倍的冷生理鹽水，混勻，經過低溫7000-8000r/min離心10min，取上清液，經過濾處理，留濾液備用；

④用稀鹽酸將濾液酸度值調PH至5.4-5.6，凈化濾液，將凈化后的濾液用0.22um濾膜過濾后收集，再將上述的濾液經過截留分子量為6000道爾頓的中空纖維膜超濾，收集濾液再次用濾膜進行無菌過濾，即為抗小鵝瘟病毒轉移因子。

步驟2）所述的蔗糖溶液分為4個遞增的蔗糖濃度梯度，分別為20-25%、30-35%、40-45%、55-60%。

步驟3）所述取免疫豬的脾臟、胸腺、淋巴等組織之前，根據免疫學的方法檢測抗原在體內產生的特異性抗體效價后，再取豬的免疫組織。

本發明制備的抗小鵝瘟轉移因子是天然純生物活性物質，能夠有效的抑制小鵝瘟病毒，對雛鵝和雛番鴨由小鵝瘟病毒引起的小鵝瘟起到治療和預防作用，從根本上保護正常機能細胞免受小鵝瘟病毒感染和侵害。脾臟、胸腺、淋巴組織等都是免疫器官，是產生免疫反應的場所，從這些組織中提取的多肽核酸復合物具有較好的特異性。

本發明提供的小鵝瘟轉移因子的制備方法簡單、操作行強、生產原料充足，可以在短時間內生產完成，主要技術包括病毒的增殖、健康豬的免疫和特異性抗體效價的檢測、轉移因子的提取、轉移因子的除菌處理和保存等，這種方法生產成本低，主要具有良好的應用前景。

具體實施方式

????結合具體實施例對本發明的內容作進一步的說明。

實施例1

一種抗小鵝瘟轉移因子的制備方法，具體制備步驟如下：