[發(fā)明專利]一種耐表面活性劑的內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶基因工程菌及其構(gòu)建方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210135861.1
• 申請日: 2012-04-26
• 公開（公告）號(hào): CN102676442A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳敬;陳晟;閆鵬安;宿玲恰;陳堅(jiān)
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/70;C11D3/386;C12R1/19
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種耐表面活性劑的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶基因工程菌的構(gòu)建方法，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

纖維素酶是指能降解纖維素的一類酶的總稱，主要包括三類，分別為內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)、纖維二糖水解酶(EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)。其中，內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶是纖維素酶系中的重要組分，能隨機(jī)水解纖維素的β-1，4-葡萄糖苷鍵，產(chǎn)生纖維低聚糖，廣泛用于紡織和洗滌等工業(yè)。內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶的產(chǎn)生菌很多，主要有絲狀真菌、細(xì)菌等。目前研究最多的是木霉(Trichoderma)。?

附著在衣物表面的污垢易被傳統(tǒng)洗滌劑清洗，而在衣物間隙中的污垢與衣物粘黏在一起難以洗凈，反復(fù)洗滌以后，衣物便會(huì)發(fā)舊泛黃。將內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶加入洗滌劑中，改變了傳統(tǒng)的去污機(jī)理，它使棉織物的纖維素結(jié)構(gòu)膨松，利于洗滌劑成分進(jìn)人纖維間隙與污垢充分接觸，從而大大提高了洗滌效果，并且用添加纖維素酶的洗滌劑洗過的衣物，色澤鮮艷、柔軟，對衣物損傷小。?

洗滌劑中通常含有大量的表面活性劑，易造成酶蛋白部分或者完全變性失活。因此要求添加到洗滌劑中的纖維素酶對表面活性劑具有一定的耐受力。Andre等從土壤中篩選到Streptomyces?drozdowiczii并分離純化出其中的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶，研究了其在商品化洗滌劑環(huán)境中的穩(wěn)定性，室溫放置一小時(shí)后酶活降低15％左右；Jinichiro等從Staphylotrichum?coccosporum中分離純化出內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶STCE1，研究發(fā)現(xiàn)STCE1是45家族中對表面活性劑耐受力最好的內(nèi)切酶。?

近年來，隨著洗滌工業(yè)的發(fā)展，洗滌用內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶的需求量日益增大，因此篩選耐表面活性劑的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶，并且構(gòu)建適合大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的基因工程菌顯得日趨重要。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種耐表面活性劑的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶基因工程菌，是以攜帶重組質(zhì)粒表達(dá)耐表面活性劑的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶基因的大腸桿菌E.coli?BL21(DE3)。?

本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種構(gòu)建所述基因工程菌的方法，通過克隆內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶基因cel5A(NCBI編碼：3579455)到pET-24a載體，以E.coli?BL21(DE3)為表達(dá)宿主，實(shí)現(xiàn)了內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶Cel5A的高效表達(dá)。?

所述重組質(zhì)粒為pUC系列，pET系列，pT7-7，或pGEX中的任意一種。?

本發(fā)明提供的重組酶在洗滌劑常用的表面活性劑中穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，包括如下步驟：重組酶中分別加入終濃度為1mM的幾種洗滌劑中常用的表面活性劑，25℃下，保溫一小時(shí)后測定殘留酶活。?

所述的表面活性劑為脂肪醇聚氧乙烯九醚、壬基酚聚氧乙烯醚和陰離子表面活性劑直鏈烷基苯磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉中任一種。?

附圖說明

圖1重組內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶Cel5A搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶曲線。?

圖2重組內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶Cel5A蛋白SDS-PAGE圖。?

1、發(fā)酵液上清；2、破壁上清；3、包涵體；M、標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量。?

圖3重組內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶Cel5A分批補(bǔ)料發(fā)酵產(chǎn)酶曲線。?

圖4重組內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶Cel5A分離純化SDS-PAGE圖。?

1、純化后樣品；2、發(fā)酵液；M、標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量。?

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：基因工程菌的構(gòu)建?

1、根據(jù)NCBI上登錄的cel5A的基因序列(Genbank號(hào)3579455)，以嗜熱子囊菌(Thermobifidafusca)總DNA為模板，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法合成內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶Cel5A的基因序列，連接到pMD18-Tsimple載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB平板。經(jīng)37℃培養(yǎng)過夜，挑選菌落，接入LB液體培養(yǎng)基，8～10h后提取質(zhì)粒，命名為pMD18-T?simple-cel5A，將此質(zhì)粒進(jìn)行序列測定。結(jié)果表明此基因全長1293個(gè)核苷酸，和NCBI上登錄的cel5A的基因序列完全相同。?