[發明專利]豬繁殖與呼吸綜合癥病毒受體CD163敲除豬及培育方法

無效

• 申請號: 201210135794.3
• 申請日: 2012-05-04
• 公開（公告）號: CN102715132A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 賴良學;逄大欣;歐陽紅生;任林柱;宋娜;于飛飛;楊鑫;陳福旺;曹宇航;李莉
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027;C12N15/63;C12N5/10
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

1.一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒受體CD163敲除豬，其特征在于：

在敲除豬體內CD163基因不表達。

2.權利要求1所述豬繁殖與呼吸綜合癥病毒受體CD163敲除豬的培育方法，包括以下步驟：

1）PRRSV受體CD163基因敲除載體的構建

分別克隆豬CD163基因同源左臂和同源右臂序列，然后將上述同源臂亞克隆至含正向篩選基因Neo和負向篩選基因TK的pSSC-9載體，構建含正負篩選標記的CD163基因敲除載體pSSC-Larm-Sarm-CD163；

1.1）用PCR擴增豬的CD163基因同源左臂和同源右臂序列

用同源臂擴增引物分別擴增CD163基因同源左臂和同源右臂序列；

1.2）將CD163基因同源左臂和同源右臂序列分別與pGM-T相連接，分別構建成pGM-T-Sarm-CD163和pGM-T-Larm-CD163；

1.3）用BamHI和HindIII酶切pGM-T-Sarm-CD163，回收CD163基因同源右臂Sarm片段；用SalI酶切pGM-T-Larm-CD163，回收CD163基因同源左臂Larm片段；將CD163基因同源左臂與同源右臂先后連接至pSSC-9載體上，構建成含正負篩選標記的CD163基因敲除載體pSSC-Larm-Sarm-CD163；

2）CD163基因敲除豬胚胎成纖維細胞系的建立

將上述構建的基因敲除載體pSSC-Larm-Sarm-CD163線性化后，用脂質體法轉染到豬胚胎成纖維細胞中，對經抗性篩選獲得的陽性細胞進行基因敲除的鑒定，對鑒定確證發生同源重組的細胞凍存；

2.1）載體線性化：提取pSSC-Larm-Sarm-CD163質粒，用Sfi?I酶切，然后乙醇沉淀，用無菌ddH₂O溶解；

2.2）脂質體轉染：將線性化的載體按照脂質體Fugene?HD轉染小型豬成纖維細胞，5?%?CO₂，39?℃培養；

2.3）核供體細胞的獲得：用G418篩選8-10天后，獲得抗性細胞；采用PCR方法對所獲得的細胞進行鑒定，得到CD163基因敲除豬成纖維細胞；該細胞即為核供體細胞；

3）利用體細胞核移植技術構建CD163基因敲除豬

采用體細胞核移植技術，以母豬做代孕母豬，構建CD163基因敲除豬。

3.?根據權利要求2所述豬繁殖與呼吸綜合癥病毒受體CD163基因敲除豬的培育方法，其特征在于：

CD163基因敲除載體為pSSC-Larm-Sarm-CD163，該載體含有CD163基因同源左臂和同源右臂，參見圖1。

4.?權利要求2或3所述豬繁殖與呼吸綜合癥病毒受體CD163基因敲除豬的培育方法，其特征在于：

用于擴增CD163基因同源左臂和同源右臂，引物序列如下：

同源左臂的擴增引物：

PCDE2-3F：5’-ACTTTTGCTGTAGTCGCTGTTCT?-3’，?

PCDE3-4R：5’-ACTCCAGCATCCTCAGCATGATCGC?-3’；

同源右臂的擴增引物：?

PCDE5-6F：5’-AGAGTGGTAGATGGACTCACTGAAT?-3’，?

PCDE5-6R：5’-AGTGATCACAACTAAGTCCACCCCACT?-3’。

5.?權利要求1所述豬繁殖與呼吸綜合癥病毒受體CD163基因敲除豬的PCR鑒定方法，其特征在于，用于基因敲除豬陽性細胞克隆及陽性克隆豬鑒定的引物序列如下：

鑒定引物對1（JDYW1）：

5’-TATCAGGACATAGCGTTGGCTAC-3’，

5’-AGTTGCTTACATGCCACAGC-3’；

鑒定引物對2（JDYW2）：

5’-AGGATCTCGTCGTGACCCATGG-3’，?

5’-ATGGCAGTGACAGCAGTTGGA-3’；

鑒定引物對3（NEO1）：

5’-TCTGATGCCGCCGTGTT-3’，

5’-GATGTTTCGCTTGGTGGTC-3’；

鑒定引物對4（NEO2）：

5’-AGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTG-3’，

5’-AAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCG-3’。