[發明專利]澤瀉致腎毒性作用毒效部位及其制備方法

無效

• 申請號: 201210133998.3
• 申請日: 2012-05-03
• 公開（公告）號: CN102645364A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 陳曉輝;畢開順;王延年;于治國;馬超;俞悅;趙旭
• 申請（專利權）人: 沈陽藥科大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N1/34;G01N33/15;G01N30/88
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司 21207
• 代理人: 李宇彤

1.澤瀉致腎毒性作用毒效部位是澤瀉水煎液的氯仿萃取物。

2.制備權利要求1所述的澤瀉水煎液的氯仿萃取物的方法，其特征是：首先將澤瀉加入其重量8~12倍量的水，室溫冷浸過夜，加熱煮沸1~3次，每次提取0.5~2?h，過濾，合并濾液，減壓濃縮得到澤瀉水煎液提取物；其次，將濃縮后水煎液提取物，用氯仿等體積萃取2~4?次，合并萃取液，經旋轉蒸發儀50?℃，蒸干溶劑，得到氯仿萃取物。

3.如權利要求2所述制備方法，其特征在于水的加入量為澤瀉重量的10倍。

4.如權利要求2所述制備方法，其特征在于加熱煮沸次數為2次。

5.如權利要求2所述制備方法，其特征在于提取時間為1h。

6.如權利要求2所述制備方法，其特征在于萃取次數為3次。

7.確認權利要求1所述的澤瀉致腎毒性作用毒效部位是澤瀉水煎液的氯仿萃取物的試驗方法，其特征是：采用病理切片的方法，具體是

（1）制備權利要求1所述的澤瀉水煎液的氯仿萃取物；

（2）供試液的制備

取得到的氯仿萃取物，加水稀釋至相當于藥材濃度2?g/mL，作為氯仿萃取物供試液；

取關木通粉碎，加入4倍蒸餾水，浸泡30?min?后，加熱至沸騰，煎煮60?min，傾出藥液，過濾，反復煎煮2次，合并藥液，過濾，濃縮至相當于藥材濃度0.5?g/ml作為陽性對照溶液；

（3）動物分組及給藥方法

按體重隨機將動物平均分為3組：正常對照組，澤瀉氯仿萃取物組和關木通陽性對照組，將大鼠放入代謝籠適應?7?天后每天灌胃一次，連續灌胃?120?天；

（4）病理切片

于給藥120天后將大鼠處死，腎臟稱重，并取大鼠的腎組織用10％甲醛固定，石蠟包埋并作薄切片，制成?3?μm?切片，經蘇木精-依紅染色，在光學顯微鏡下觀察形態學變化。

8.確認權利要求1所述的澤瀉致腎毒性作用毒效部位是澤瀉水煎液的氯仿萃取物的試驗方法，其特征是：采用代謝組學的方法的方法，具體是

（1）制備權利要求1所述的澤瀉水煎液的氯仿萃取物；

（2）供試液的制備

取得到的氯仿萃取物，加水稀釋至相當于藥材濃度2?g/mL，作為氯仿萃取物供試液；

取關木通粉碎，加入4倍蒸餾水，浸泡30?min?后，加熱至沸騰，煎煮60?min，傾出藥液，過濾，反復煎煮2次，合并藥液，過濾，濃縮至相當于藥材濃度0.5?g/ml作為陽性對照溶液；

（3）動物分組及給藥方法

按體重隨機將動物平均分為3組：正常對照組，澤瀉氯仿萃取物組和關木通陽性對照組，將大鼠放入代謝籠適應?7?天后每天灌胃一次，連續灌胃?120?天；

（4）生物樣品的采集

尿液收集：采用代謝籠法，于給藥120?天收集24?h尿液至離心管中，尿樣13000?rpm離心3?min?后，取上清液置于-20?℃冰箱中保存備用；

血清收集：于給藥120天眼眶采血，置于試管中，放置30分鐘，取出血餅，溶液13000?rpm離心5?min，分離得到血清置于-20?℃冰箱中保存備用；

（5）代謝組學生物樣品的預處理

尿樣預處理：取尿樣?200?μL，置于?1.5?mL?EP?管中，加入?200?μL甲醇，渦旋?3?min，13000?rpm條件下離心?5?min，取上清液5?μL進行UPLC-MS分析；

血清樣品預處理：取200?μL血清加入1.5?mL?EP管中，加入?400?μL乙腈沉淀蛋白，在4?℃的低溫環境中，15000?rpm離心10?min，上清液轉移至另一EP管中，保持30?℃恒溫，在N₂氣流下吹干，用100?μL?乙腈–水(15?:?85,?v/v)復溶，超聲?3?min，渦旋?1?min，13000?rpm離心5?min?后，取上清液5?μL進行UPLC-MS分析；

（6）UPLC-MS分析方法的建立

色譜條件?色譜柱：ACQUITY?UPLC^TM?BEH?C₁₈?柱?6；柱溫：35?℃；流動相：0.1%甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脫?；

質譜條件?離子源?ESI?正離子全掃描模式，毛細管電壓?3.2?kV，錐孔電壓?30?V，離子源溫度120?℃，脫溶劑溫度?350?℃，脫溶劑氣N₂和錐孔氣N₂流速分別設置為600和50?L/h；采用全掃面掃描方式，掃描范圍為100?~?900?amu，在運用提取離子多級質譜掃描時，氬氣作為碰撞氣；NaCsI被用來在實驗前作為質量校正；

UPLC-MS分析方法的確證?尿樣和血樣分析方法的精密度和穩定性考察均符合要求；

（7）數據處理

本研究運用Markerlynx軟件進行色譜峰識別以及峰匹配，并采用主成分分析法（PCA）對各組大鼠血漿和尿樣的代謝物組進行分析。