[發明專利]一種食品中副溶血弧菌活菌的檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201210133176.5
• 申請日: 2012-05-03
• 公開（公告）號: CN102643919A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 張毅
• 申請（專利權）人: 湖北省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/63
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬于食品檢測領域，具體涉及一種食品中副溶血弧菌活菌的檢測試劑盒，同時還涉及一種食品中副溶血弧菌活菌的檢測方法。適用于動物性水產品、動物性水產品干制品、腌醉制生食動物性水產品、即食藻類食品、魚糜制品等水產食品和水產調味品，及其他加工食品。本發明適用于水產品養殖企業、水產品加工企業、超市、農貿市場、水產品批發市場的快速檢測及國家相關職能檢測機構實驗室檢測。

背景技術

副溶血性弧菌(Vibio?parahemolyticus)廣泛分布于江河、海洋及熱帶和溫帶沿海地區，主要寄生于浮游生物、魚、蝦蟹、貝類等水產品中，給水產養殖業造成巨大的經濟損失。直接或間接食用被該菌污染的食品會引發腸胃功能紊亂、急性胃腸炎、淺表創傷感染、敗血病等疾病，是引起食物中毒的重要病原體之一。在細菌性食物中毒的構成中，以副溶血弧菌引起的急性腸炎占首位。副溶血弧菌產生的毒素有溶血素和尿素酶。其致病因子主要有耐熱直接溶血毒素、耐熱直接相關溶血毒素、不耐熱溶血毒素。因此，快速靈敏的檢測手段是預防控制副溶血弧菌傳播的關鍵。通常傳統鑒定方法是分離培養、鏡檢觀察、生化鑒定及嗜鹽性試驗等，這些檢測手段不僅耗時而且操作復雜、靈敏度較低。近年來，有大量研究是基于PCR檢測方法，PCR檢測方法在操作時間，檢測的特異性和靈敏度方面較常規方法均有較大提高，但PCR檢測方法需要精密的PCR儀，它的檢測時間也較長(2～4h)，并且反應過程很容易受污染物的影響，從而使得這種方法不能滿足實地快速檢測的需求。另外還有一些檢測方法，比如免疫色譜法、DNA雜交法，雖然檢測靈敏度高，但是所需設備和操作過程比較復雜，也不能滿足實地快速檢測的需求。

環介導等溫擴增法(LAMP)是2000年開發的一種新穎的恒溫核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6個區域設計2對特異性引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件(63℃左右)保溫30～60min，即可完成核酸擴增反應。與常規PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環、電泳及紫外觀察等過程。LAMP是一種全新的核酸擴增方法，具有簡單、快速、特異性強的特點。該技術在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標上能媲美甚至優于PCR技術，不依賴任何專門的儀器設備實現現場高通量快速檢測，檢測成本遠低于熒光定量PCR。

現有技術中已經有副溶血弧菌檢測試劑盒和檢測方法，但在實際使用過程中存在著無法區分副溶血弧菌活體菌與死菌，對檢測結果準確性影響很大，常出現假陽性結果。

發明內容

本發明的目的是在于提供了一種食品中副溶血弧菌活菌的檢測試劑盒，能快速檢測食品中副溶血弧菌活菌，與PCR檢測方法相比較，EMA-LAMP檢測方法提高了檢測特異性、靈敏度和準確性。與傳統LAMP檢測方法相比較，EMA-LAMP檢測方法可以區分試樣中的活菌和死菌，只檢測樣本中存在的副溶血弧菌活菌，檢測結果更加準確，極大的降低了假陽性結果產生。同時傳統LAMP檢測方法其特點是針對靶基因的6個區域設計2對特異性引物，而本發明對傳統LAMP檢測方法進行了創新，其特點是針對靶基因的6個區域設計3對特異性引物，使得檢測特異性、靈敏度和準確性均有較大的提高。

本發明的另一個目的是在于提供了一種食品中副溶血弧菌活菌的檢測試劑盒的檢測方法，方法易行，操作簡便，快速、靈敏的檢測食品中副溶血弧菌活體菌，該方法在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標上能媲美甚至優于PCR技術，不依賴任何專門的儀器設備實現現場高通量快速檢測，檢測成本遠低于熒光定量PCR。

為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施：

一種副溶血弧菌LAMP檢測試劑盒，其特征在于：該試劑盒它包括以下成分：10×反應緩沖液；Bst?DNA聚合酶；dNTPs；MgSO₄；DNase/RNase-Free?ddH₂O；引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物Loop-F、引物Loop-R；疊氮溴化乙錠；1000×SYBR?Green?I熒光染料。

10×反應緩沖液配方：200mM?Tris-HCl、100mM?KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、1.0％(質量體積比)Tritonx-100。

引物F3：5’AGCTACTCGAAAGATGATCC?3’

引物B3：5’GGTTGTATGAGAAGCGATTG?3’

引物FIP：5’ATGTTTTTAAATGAAACGGAGCTCCGGCAAAAAACGAAGATGGT?3’