[發明專利]對bZIP類轉錄因子具有調控作用的基因、其克隆方法及其應用

有效

• 申請號: 201210133082.8
• 申請日: 2012-05-03
• 公開（公告）號: CN102653766A
• 公開（公告）日: 2012-09-05
• 發明（設計）人: 宋任濤;張男;喬禎逸;梁錚;許政暟
• 申請（專利權）人: 上海大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/10;C12N15/63
• 代理公司: 上海上大專利事務所(普通合伙) 31205
• 代理人: 陸聰明

技術領域

本發明涉及一種對bZIP類轉錄因子具有調控作用的基因、其克隆方法及其應用。

背景技術

玉米（Zea?mays）是世界上種植面積最大并且產量最大的禾本科作物之一，大多用于動物飼料，食物以及工業原料，在工農業中均有著廣泛的應用。玉米對于現代社會的發展起到了重要作用。但是，由于玉米蛋白質中必需氨基酸含量不完整，尤其是胚乳中含量最高的α醇溶蛋白（22kD醇溶蛋白和19kD醇溶蛋白）的賴氨酸和色氨酸嚴重缺乏，導致玉米本身的營養價值較差，長期以玉米為單一糧食會導致嚴重的營養不良。為了改進玉米的蛋白質質量，人們進行了大量的科學研究。

Opaque-2是一個含有bZIP結構域的轉錄因子，并且在1987年被人們通過轉座子標簽技術克隆。Opaque-2突變體表現出了典型的粉質胚乳（圖1），并且在生化成分含量中，o2相對于野生型籽粒表現出了高含量的賴氨酸和色氨酸。因此，Opaque-2是一個著名的籽粒高賴氨酸突變體。目前研究表明，轉錄因子Opaque-2在玉米胚乳中專一的調控22kD醇溶蛋白的表達，并且部分調控19kD醇溶蛋白的表達。由于之前的研究中已經發現，Opaque-2可以和一些非醇溶蛋白產生物理結合，因此，可以認為，Opaque-2在玉米籽粒發育過程中可能還擔負著一些其他的重要使命。從Opaque-2克隆至今，人們通過一些方法找到了一些疑似和Opaque-2有關的基因，如：PBF、OHP1、GCN5，但是對于Opaque-2在玉米籽粒發育中具體的調控機制依然不為人知。

鑒于Opaque-2本身轉錄因子的分子結構以及其調控的下游蛋白在玉米籽粒中的重要作用，人們普遍認為Opaque-2是一個在籽粒發育中起到重要作用的轉錄因子。解釋Opaque-2的具體功能對于人們改進玉米蛋白質品質具有極為重要的意義。根據之前研究的經驗來看，通過蛋白相互作用的方法在轉錄后水平來尋找調控Opaque-2的蛋白不失為一個重要的手段。蛋白相互作用的方法包括酵母雙雜篩庫、體外的Pull-down、體內的免疫共沉淀（CoIP）等。

酵母雙雜實驗是基于酵母體系在酵母體內篩選可能有互作的兩個蛋白的方法。該實驗可以大范圍地篩選可能有直接互作的兩個蛋白。但是，其背景信號較高，會有一些假陽性的情況出現。

Pull-down是基于免疫沉淀和Western技術發展來的體外或者半體內來檢測蛋白互作的一門技術。該技術通過抗體的特異性吸附以及互作蛋白之間的相互物理性的結合來進行互作驗證。該實驗方法相對于酵母雙雜可以大幅降低背景，但是還是不能完全體內地來驗證蛋白互作。

由Pull-down技術發展而來的免疫共沉淀技術可以在體內情況下驗證蛋白互作。該技術原理和Pull-down一致，都是利用了免疫沉淀和Western技術來檢測蛋白互作。但是和Pull-down不同的是免疫共沉淀完全采取了內源的組織細胞表達的蛋白。因此，免疫共沉淀的難度更大對抗體的要求更高，但是結果更可靠。

此外，一些其他的實驗方法也可以用來進行蛋白互作之后的功能分析。包括亞細胞定位以及蛋白在植物細胞瞬時表達的酶活測定等。

亞細胞定位主要是基于以熒光蛋白為標簽的瞬時轉化技術。可以通過基因槍對洋蔥表皮細胞瞬時轉化以及農桿菌侵染煙草表皮細胞或者原生質體等方法來實現對蛋白的亞細胞定位。

在對互作蛋白的功能分析中，采取以GUS為報道基因，熒光素酶為內參通過酶標儀來測定酶活的方法來對互作蛋白的功能分析進行定量檢測。

發明內容

本發明的目的之一在于通過酵母雙雜技術篩選出了一個對bZIP類轉錄因子具有調控作用的基因，稱為ZmTaxilin。該基因在酵母中和Opaque-2有相互作用。

本發明的目的之二在于提供該基因的克隆方法。

本發明的目的之三在于提供其應用價值。

為達到上述目的，本發明采用如下技術方案為：

一種對bZIP類轉錄因子具有調控作用的基因，其特征在于該基因為SEQ?ID?NO：1所示的堿基序列。

一種克隆上述的對bZIP類轉錄因子具有調控作用的基因，其特征在于該方法的具體步驟為：

a.將均一化的玉米籽粒cDNA片段與單雜載體pGADT7-Rec連接轉化，構建餌質粒，選取其中包含bZIP結構域以及核定位信號又屏蔽了其轉錄激活結構域O2-2片段，將其連入pGBKT7載體中，構建庫質粒；