[發(fā)明專利]麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達(dá)產(chǎn)物在制藥中的應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210132433.3
• 申請(qǐng)日: 2012-04-28
• 公開（公告）號(hào): CN102657879A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 向鳳寧;趙忠娟;劉艷玲;呂欣;李碩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類號(hào): A61K48/00
• 分類號(hào): A61K48/00;A61P1/16;A61P35/00
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及抗癌藥物的制備，尤其涉及一種麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達(dá)產(chǎn)物在制備抗肝癌藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

高寒藏藥麻花艽系龍膽科(Gentianaceae)、龍膽屬(Gentiana)，主要分布于西藏、青海、甘肅海拔2500-4700米的高寒地區(qū)，多年生草本，全草及根入藥，由于其分布散，生長(zhǎng)期長(zhǎng)，藥材收集極為困難，因而已成為瀕危物種。主治黃膽性肝炎，風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、結(jié)核病潮熱、哮喘、抽搐、休克、過(guò)敏反應(yīng)。富含五環(huán)三萜類次生代謝物，β-amyrin(β-香樹素)是其中的一類重要的三萜類化合物。

β-amyrin是植物中最常見的三萜類化合物之一。它的五碳環(huán)骨架，折疊為椅式構(gòu)象，是由2，3-氧化角鯊烯經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)在β-amyrin合成酶催化下形成的。而其合成酶是該途徑中非常重要的限速酶，控制著這些藥用成分前體合成的第一步反應(yīng)，因此對(duì)該基因的克隆具有極其重要的意義。齊墩果酸是該反應(yīng)中的最終產(chǎn)物，在龍膽科植物麻花艽中β-amyrin合成酶基因?qū)τ诳垢窝子行С煞铸R墩果酸的積累具有很高的促進(jìn)作用。

到現(xiàn)在為止，已從許多雙子葉植物中分離到了β-amyrin合成酶基因，如雙子葉人參中的PNY1，PNY2；干草中的GgbAS1；豌豆中的PSY；還有截形苜蓿和白樺等：?jiǎn)巫尤~植物燕麥中的AsbAS1。并有文章報(bào)道對(duì)其功能的驗(yàn)證。盡管麻花艽中β-amyrin合成酶基因GsAS的克隆和功能驗(yàn)證已有報(bào)道，但是，利用麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達(dá)產(chǎn)物制備抗肝癌藥物還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達(dá)產(chǎn)物在制備抗肝癌藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達(dá)產(chǎn)物在制備抗肝癌藥物中的應(yīng)用，其中：所述肝癌細(xì)胞是HepG2肝癌細(xì)胞或SMMC7721肝癌細(xì)胞；有效抑制HepG2肝癌細(xì)胞或SMMC7721肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達(dá)產(chǎn)物濃度為1～25μg/mL，優(yōu)選濃度為10μg/mL。

本發(fā)明提供的麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達(dá)產(chǎn)物為研制開發(fā)抗肝癌藥物奠定了基礎(chǔ)。

為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面用麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達(dá)產(chǎn)物藥理實(shí)驗(yàn)及結(jié)果來(lái)說(shuō)明其在抗肝癌藥物制備中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達(dá)產(chǎn)物的制備：

利用麻花艽cDNA為模板，克隆得到β-amyrin合成酶基因GsAS，構(gòu)建酵母表達(dá)載體pPICZA-GsAS，轉(zhuǎn)化酵母，酵母轉(zhuǎn)化后會(huì)形成甲醇誘導(dǎo)型(Mut⁺)和甲醇敏感型(Mut^s)菌株，在MM培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而在MD培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)的菌株為Mut^s型酵母菌株，而在兩種培養(yǎng)基上都能生長(zhǎng)的為Mut⁺型酵母菌株。對(duì)比pPICZA-GsAS酵母轉(zhuǎn)化子在含MM(含甲醇培養(yǎng)基)和MD(無(wú)甲醇培養(yǎng)基)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，篩選出Mut⁺酵母轉(zhuǎn)化子。挑選Mut⁺酵母菌于25mL?MGY培養(yǎng)基中28℃振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀＝2-6，轉(zhuǎn)接到100-200mL?MM培養(yǎng)基中，使其OD₆₀₀＝1.0。繼續(xù)28℃振蕩培養(yǎng)，每24小時(shí)加一次甲醇(終濃度0.5％)，震蕩培養(yǎng)4d，收集菌體備用。

取甲醇誘導(dǎo)4天的酵母溶液加入50mL的離心管中，離心菌體，用液氮研磨菌體；加入3-4mL體積比為2∶1的甲醇-氯仿(色譜純)，超聲波破壁30min；10000rpm，離心，上清液用氯仿萃取，并用水洗，重復(fù)操作。收集氯仿層溶液，水浴蒸餾濃縮，回收溶劑得浸膏。

β-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達(dá)產(chǎn)物的藥理實(shí)驗(yàn)：

正常組：10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)上指數(shù)期正常貼壁生長(zhǎng)的HepG2肝癌細(xì)胞或SMMC7721肝癌細(xì)胞；對(duì)照組：用溶劑甲醇作對(duì)照；實(shí)驗(yàn)組：浸膏用甲醇溶解，用于處理HepG2肝癌細(xì)胞或SMMC7721肝癌細(xì)胞的濃度為0.5，1，5，10，25，50，75，100μg/mL。