[發(fā)明專利]發(fā)夾型核酸熒光探針及其在檢測鉛離子的應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210128619.1
• 申請日: 2012-04-28
• 公開（公告）號: CN102703441A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金燕;王文紅;趙毅娜
• 申請（專利權(quán)）人: 陜西師范大學(xué)
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 西安永生專利代理有限責(zé)任公司 61201
• 代理人: 申忠才

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于發(fā)夾核酸熒光探針構(gòu)型的轉(zhuǎn)變檢測鉛離子。

背景技術(shù)

重金屬原義是指比重大于5的金屬，包括金、銀、銅、鐵、鉛等，重金屬在人體中累積達(dá)到一定程度，會造成慢性中毒。對環(huán)境污染和人體毒害最大的有5種：鉛、汞、鉻、砷、鎘。這些重金屬在水中不能被分解，人飲用后毒性放大，與水中的其他毒素結(jié)合生成毒性更大的有機(jī)物或無機(jī)物。鉛，是重金屬污染中毒性較大的一種，一但進(jìn)入人體很難排除。直接傷害人的腦細(xì)胞，特別是胎兒的神經(jīng)板，可造成先天大腦溝回淺，智力低下；對老年人造成癡呆、腦死亡等。英國科學(xué)家研究表明，鉛可以縮短人的壽命，如果人類飲食鉛的含量為零，那么人的壽命將過140歲。因此，鉛離子的快速靈敏檢測對人類健康和環(huán)境監(jiān)測都有著十分重要的意義。

傳統(tǒng)的檢測鉛離子的方法有原子吸收光譜法、電感耦合等離子體法等，都可以有效地檢測鉛離子，但這些方法需要大型儀器，操作復(fù)雜，樣品的使用量大，無法進(jìn)行痕量檢測，因此限制了其廣泛的應(yīng)用。

近幾十年來發(fā)展的檢測鉛離子的方法有比色法、電化學(xué)分析法、熒光分析法，這種方法靈敏度低，重現(xiàn)性差，一般很少采用；電化學(xué)分析法，雖然靈敏度較高，但耗時耗力，選擇性差，不利于快速檢測樣品；熒光分析法，靈敏度高，選擇性好，時間短，可以進(jìn)行痕量檢測，因此得到廣泛應(yīng)用。

檢測鉛離子的熒光核酸探針越來越多，像8-17核酸酶，由H.Wang，Y.Kim，H.P.Liu，Z.Zhu，S.Bamrungsap?and?W.H.Tan，Engineering?a?Unimolecular?DNA-Catalytic?Probe?for?Single?Lead?Ion?Monitoring，J.Am.Chem.Soc.，2009，131(23)，8221-8226公開；納米粒子由F.Chai，C.Wang，T.Wang，L.Li，and?Z.Su，Colorimetric?Detection?of?Pb²⁺Using?Glutathione?Functionalized?Gold?Nanoparticles，ACS?Appl.Mater.Interfaces，2010，2(5)，1466-1470公開；G4核酸酶由T.Li，S.Dong?and?E.Wang，A?Lead(II)-Driven?DNA?Molecular?Device?for?Turn-On?Fluorescence?Detection?of?Lead(II)Ion?with?High?Selectivity?and?Sensitivity.J.Am.Chem.Soc.，2010，132(38)，13156-13157公開。其中分子信標(biāo)作為發(fā)夾結(jié)構(gòu)的熒光核酸探針，是一種極好的生物分子傳感器。分子信標(biāo)技術(shù)具有極高的特異性，而且操作簡便、靈敏度高，特別是它可以進(jìn)行實(shí)時定量檢測、甚至可以用于活體分析在臨床診斷、基因檢測等領(lǐng)域，分子信標(biāo)也越來越顯示出它的優(yōu)勢。但是一般的分子信標(biāo)是雙標(biāo)記的核酸探針，造成其成本高，應(yīng)用受限。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的一個技術(shù)問題在于克服已有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種識別性能好、特異性高、選擇性好、靈敏高的發(fā)夾型核酸熒光探針。

本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題在于為發(fā)夾型核酸熒光探針提供一種新用途。

解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：發(fā)夾型核酸熒光探針的序列為5’-FAM-CGTCATGGGTGGGTGGGTGGGTGACGGGG-3’。

上述發(fā)夾型核酸熒光探針的合成方法由下述步驟組成：

脫保護(hù)：將預(yù)先連接在固相載體控制微孔玻璃上的活性基團(tuán)被保護(hù)的核苷酸與12.1gmL三氯乙酸反應(yīng)，脫去其5′-羥基的保護(hù)基團(tuán)二甲氧基三苯甲基，獲得游離的5′-羥基。

縮合：合成DNA的原料-單體，與2.9mL活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3′端被活化，5′-羥基仍然被二甲氧基三苯甲基保護(hù)，與溶液中游離的5′-羥基發(fā)生縮合反應(yīng)。

帶帽反應(yīng)：用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)。

氧化：在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿崛ァ?/p>

通過上述步驟，一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基被連接上去。合成過程中可以觀察三氯乙酸處理階段的顏色判定合成效率。

氨解：通過氨水55℃處理，連接在控制微孔玻璃上的引物被切下來。