[發明專利]快速篩選分泌耐有機溶劑蛋白酶微生物的方法

無效

• 申請號: 201210127417.5
• 申請日: 2012-04-27
• 公開（公告）號: CN102643745A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 房耀維;劉姝;王淑軍;呂明生;焦豫良
• 申請（專利權）人: 淮海工學院
• 主分類號: C12N1/00
• 分類號: C12N1/00
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 劉喜蓮

1.一種快速篩選分泌耐有機溶劑蛋白酶微生物的方法，其特征在于，其步驟如下：

（1）樣品采集：用無菌取樣瓶采集土壤或水樣品，4℃保存；

（2）富集培養：取0.5g樣品加入2216E培養基中，25℃，140rpm?培養24h，得富集液；

（3）平板制備：

LB平板制備：每個直徑9cm的平皿加入15ml?LB?固體培養基；

有機溶劑、脫脂乳雙層平板制備：

下層平板：將甲苯、20g/L?PVA按體積比1:3置于燒杯中，300W?超聲波乳化，超聲5s，間歇5s，再超聲5s，共5min，制備成乳化液；20g/L瓊脂、1?g/L?MgSO₄·7H₂O，1?g/L?CaCl₂，10g/L脫脂乳，pH?7.0，115℃滅菌20min，待溫度降至約60℃，加入20%?乳化液，混勻后加8?mL到直徑9cm的平皿；

上層平板：5?g/L蛋白胨，5?g/L酵母膏，1?g/L?CaCl₂，pH?7.0，115℃滅菌20min，待下層瓊脂凝固后，加8?mL到平皿中；

脫脂乳雙層平板制備：

下層平板：20g/L瓊脂、1?g/L?MgSO₄.7H₂O，?10g/L脫脂乳，pH?7.0，115℃滅菌20min，每個平皿8?mL；

上層平板：5?g/L蛋白胨，5?g/L酵母膏，1?g/L?CaCl₂，海水配制，pH?7.0，115℃滅菌20min，待下層瓊脂凝固后，加入8?mL到平皿；

（4）分離篩選：對富集液進行梯度稀釋，取50μL不同稀釋度的稀釋液涂布LB平板，25℃倒置培養36h，用一小塊滅菌的絲絨固定在直徑較平板小的圓柱形木塊上做成影印工具，將菌落影印到有機溶劑、脫脂乳雙層平板和脫脂乳雙層平板，25℃倒置培養值菌落36h，分別測定兩個雙層平板同樣位置產生的透明圈直徑，計算有機溶劑、脫脂乳雙層平板上透明圈直徑和橄欖油雙層平板上透明圈直徑的比值，比值越大，蛋白酶耐有機溶劑性能越強，依此篩選得到分泌耐有機溶劑蛋白酶的微生物。