[發明專利]一種利用沙鼠腎細胞制備腸道病毒疫苗的方法

有效

• 申請號: 201210126352.2
• 申請日: 2012-04-26
• 公開（公告）號: CN102657857A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發明（設計）人: 朱函坪;朱智勇;蔣健敏;錢磊;徐芳;姚蘋蘋;楊章女;謝榮輝;周小龍
• 申請（專利權）人: 浙江省疾病預防控制中心
• 主分類號: A61K39/125
• 分類號: A61K39/125;A61K39/295;A61P31/14;C12N5/071
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

1.一種利用沙鼠腎細胞制備腸道病毒疫苗的方法，所述方法包括：

(1)取10～15天齡的沙鼠，處死，無菌取下腎組織，剪碎，以含100U/ml卡那霉素的MEM培養液洗2次，離心去盡洗液；

(2)腎組織加10倍質量的含0.25％胰蛋白酶的消化液，4℃消化過夜；

(3)終止消化后棄去消化液，用MEM培養液洗滌，加質量為腎組織質量10倍的MEM培養液反復吹打，分散細胞，加新生牛血清至其終濃度為3％，接種至細胞瓶，36℃培養箱中培養；

(4)當培養至細胞生長達到50％～60％融合時，換含3％新生牛血清的MEM培養液繼續培養，當細胞達到95％融合時，用于病毒接種；

(5)取95％融合的腎單層細胞培養瓶，棄培養液，接種病毒滴度為1×10^3.0～5×10^3.0TCID₅₀的含腸道病毒的病毒液，置35℃培養箱中使病毒吸附2h，棄病毒液，加含1％新生牛血清、100U/ml卡那霉素的MEM培養液，35℃培養至細胞出現病變，收獲上清液；

(6)收獲的上清液作為病毒液接種至新制備的95％融合的腎單層細胞，按步驟(5)重復操作6～7次，直至收獲的上清液中病毒滴度大于1×10^6.0TCID₅₀，離心去除細胞碎片，加10％新生牛血清，再加病毒液2倍體積量的脫脂牛奶，混勻，即為病毒毒種，分裝后，-80℃保存備用；

(7)取步驟(6)病毒毒種，接種至新制備的95％融合的腎單層細胞培養瓶，置35℃培養箱中使病毒吸附2h，棄病毒液，用MEM培養液洗3次，加含100U/ml卡那霉素的無牛血清的MEM培養液，35℃培養2～3天，收獲病毒上清液；

(8)所得病毒上清液滅活后，經10萬分子量孔徑的超濾膜濃縮，再過Sepharose或Sephacryl凝膠柱層析，收獲第一峰，即為疫苗原液；疫苗原液經PBS稀釋使抗原量為1∶160，按0.5％比例加人血白蛋白，得疫苗半成品，疫苗半成品再經檢驗、分裝，即為疫苗成品。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述腸道病毒為腸道病毒EV71或CoxA16。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述疫苗為EV71與CoxA16雙價疫苗，將腸道病毒EV71和CoxA16分別按步驟(1)～(8)方法制得疫苗半成品，再按比例混合，經檢驗、分裝后，得到EV71與CoxA16雙價疫苗成品。