[發明專利]牛乳腺特異性表達載體pBC-αs1及制備方法

有效

• 申請號: 201210126079.3
• 申請日: 2012-04-26
• 公開（公告）號: CN102653773A
• 公開（公告）日: 2012-09-05
• 發明（設計）人: 郭宏;李光鵬;丁向彬;劉新峰;葛秀國;李吉霞
• 申請（專利權）人: 天津農學院;內蒙古大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 韓奎勇

技術領域

本發明屬于生物技術領域中的基因工程技術領域，尤其是一種牛乳腺特異性表達載體pBC-αs1及制備方法。

背景技術

動物乳腺組織特異性高效表達載體是研制乳腺反應器的重要生物元件，外源基因在動物乳腺中的高效表達必須依賴好的表達載體。

酪蛋白是哺乳動物包括母牛，羊和人奶中的主要蛋白質，牛奶中存在著4種酪蛋白，分別為αS1酪蛋白、αS2酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白，其中αS1酪蛋白在牛乳蛋白中含量最高，約為13g/L。牛酪蛋白基因座位存在座位控制區域(locus?control?region，LCR)，因而使得酪蛋白基因可以成為一個完全獨立的表達單位。牛αS1-酪蛋白基因是制備乳腺生物反應器常用的表達載體，可以指導外源基因在動物乳腺中高水平表達。要在乳腺中表達外源基因，必需有一個高效的、乳腺特異性表達的啟動區，顯然，牛αS1酪蛋白基因的啟動區是最好的候選啟動區。

牛αS1-酪蛋白基因全長17508bp，其中19個外顯子占1138bp，大小在24～385bp；18個內含子占16370bp，長度為90～1967bp。53bp的第1外顯子為5′非翻譯區，信號肽基因以及成熟蛋白質的前2個氨基酸由63bp的第2外顯子編碼。第18外顯子和含有polyA信號的第19外顯子為3′非翻譯區。除終止密碼子UGA是由第17外顯子的最后2個堿基UG和第18外顯子的第1個堿基A經剪切后拼接而成外，其余三聯體密碼子均不受剪切影響，因此第3到第16外顯子都是三堿基對的倍數。16個編碼外顯子中有9個均以“GAX”起始，這與cDNA序列分析結果一致。序列中主要的磷酸化位點是由第10外顯子的第1個密碼子(GAA)與前一外顯子拼接后產生。

牛αS1-酪蛋白基因的重要調控元件均位于啟動區-400～-10。利用乳蛋白基因啟動區進行乳腺特異性表達的轉基因試驗表明，只要乳蛋白基因啟動區包括了-500～+500的區域，一般就能夠進行高水平的乳腺特異性表達。從牛αS1酪蛋白基因啟動區來看它不具有CAAT盒，TATA盒序列“TTTAAAT”為一弱啟動區，但牛αS1酪蛋白基因的表達量卻很高，因此推測除了5′端調控機制外，內含子及3′端在表達過程中會起到一定的作用。內含子上的剪接信號也能刺激轉錄，因為RNA的加工與轉錄是一個互動的過程，剪接過程能反饋促進RNA聚合酶的活動。內含子除能促進轉錄外還可影響翻譯。將成熟的mRNA直接注射到核中，當它被運送到胞質中時并不能進行翻譯，而在注射核酸結合蛋白的抗體或mRNA的3′端非編碼區包含1個可剪接的內含子時，上述抑制被解除。有很多試驗都表明采用基因組基因表達構件比采用cDNA表達構件提高表達量10～100倍。此外，異源內含子(特別是第1、2內含子)可提高外源基因(特別是以cDNA為表達構件)的表達效率。此外，內含子上的剪接信號也能刺激轉錄，因為RNA的加工與轉錄是一個互動的過程，剪接過程能反饋促進RNA聚合酶的活動。內含子除能促進轉錄外還可影響翻譯。

LoxP(locus?of?X-over?P1)序列來源于P1噬菌體，是有兩個13bp反向重復序列和中間間隔的8bp序列共同組成，8bp的間隔序列同時也確定了LoxP的方向。Cre在催化DNA鏈交換過程中與DNA共價結合，13bp的反向重復序列是Cre酶的結合域。Loxp位點與Cre重組酶構成Cre-LoxP重組酶系統，是條件性基因打靶、誘導性基因打靶、時空特異性基因打靶策略的技術核心。Cre-LoxP系統既可以在細胞水平上用Cre重組酶表達質粒轉染中靶細胞，通過識別LoxP位點將抗性標記基因切除，又可以在個體水平上將重組雜合子小鼠與Cre轉基因小鼠雜交，篩選子代小鼠就可得到刪除外源標記基因的條件性敲除小鼠。

絕緣子是一種順式作用元件。長約數百個核苷酸對，通常位于啟動子正調控元件或負調控元件之間的一種調控序列，可防止其他基因或調控信號對目的基因的影響及異染色質的形成。

目前所具有的乳腺特異性表達載體雖然已經不斷開發出來，但并不豐富，表達效果各有偏重，通過檢索，我們檢索到公開號為：CN?1873011A，名稱為：高表達水平的轉基因動物乳腺特異性載體的構建方法，及申請號為：200810105011.0，名稱為：乳腺特異性表達載體及其構建方法，的相關發明專利，但以上發明專利的乳腺特異性表達載體與本發明的乳腺特異性表達載體構成有著本質的不同，其表達效果也不相同。

發明內容