[發(fā)明專利]一種黃酒用氨基甲酸乙酯降解酶產(chǎn)生菌

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210125030.6
• 申請(qǐng)日: 2012-04-26
• 公開（公告）號(hào): CN102676399A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 田亞平;谷曉蕾;吳延濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/14
• 分類號(hào): C12N1/14;C12R1/80
• 代理公司: 無錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所 32104
• 代理人: 時(shí)旭丹;劉品超

技術(shù)領(lǐng)域

一種黃酒用氨基甲酸乙酯（EC）降解酶產(chǎn)生菌，涉及該菌的鑒定及所產(chǎn)酶的基本特性，具體的說是從小鼠的腸道中分離出一株可以產(chǎn)生EC降解酶產(chǎn)生菌，通過ITS序列法鑒定其種屬。對(duì)提取獲得的粗酶分析其最適pH、最適溫度、pH值和溫度穩(wěn)定性范圍、底物的特異性以及乙醇耐受性等基本特性，并考察其在黃酒中的初步應(yīng)用效果。屬于與食品質(zhì)量提升相關(guān)的小酶種產(chǎn)生菌及酶特性研究領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

氨基甲酸乙酯（ethyl?carbamate，簡(jiǎn)稱為EC）可以引起肺腫瘤、淋巴癌、肝癌、皮膚癌等。一般認(rèn)為EC主要的致癌機(jī)理是：約0.1%的氨基甲酸乙酯被細(xì)胞色素P450氧化為N-羥基-氨基甲酸乙酯，后者能夠誘導(dǎo)Cu²⁺調(diào)控的DNA損傷，這種損傷多發(fā)生于胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的殘基上，進(jìn)而影響生物的遺傳物質(zhì)，引發(fā)癌變。?

國(guó)內(nèi)外對(duì)酒中氨基甲酸乙酯的研究表明，酒中氨基甲酸乙酯形成的主要途徑為尿素途徑，我國(guó)黃酒及日本清酒中90％以上的氨基甲酸乙酯是來源于酒中所含尿素與乙醇的反應(yīng)：?

通過氨基甲酸乙酯的形成途徑的分析可知，發(fā)酵食品(如面包、酸牛奶、乳酪、醬油等）和酒精飲料（如葡萄酒、蘋果酒、中國(guó)黃酒和日本清酒等）中EC的形成主要來自尿素和乙醇的反應(yīng)。降低黃酒中EC含量的方法可分為傳統(tǒng)工藝的改良和酶解法。目前，利用酶解法去除黃酒中EC已成為現(xiàn)在及將來的發(fā)展趨勢(shì)。尿素是生成氨基甲酸乙酯的前體物質(zhì)，利用酸性脲酶處理黃酒，可以除去黃酒中大部分尿素，因而減少生成氨基甲酸乙酯的可能性。而氨基甲酸乙酯降解酶則能直接作用于氨基甲酸乙酯，有效分解其為尿素和氨，減少黃酒中已經(jīng)產(chǎn)生的EC含量。本發(fā)明中一株EC降解酶產(chǎn)生菌株的發(fā)現(xiàn)和對(duì)其相關(guān)的研究，為未來黃酒中EC含量更好的減少和控制提供較好的補(bǔ)充手段。

隨著生活水平的日益提高，國(guó)內(nèi)對(duì)酒飲料的消費(fèi)量日趨上升，尤其是葡萄酒、米酒、黃酒、啤酒等含酒精飲料更是成為人們消費(fèi)的熱點(diǎn)，因此有效的降低酒精飲品中的EC含量水平勢(shì)在必行。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)EC降解酶的菌株，該EC降解酶在清酒、黃酒、米酒等發(fā)酵食品的生產(chǎn)條件下具有較好的活性；本發(fā)明提供該菌以及該菌所產(chǎn)的EC降解酶的相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)及該酶在黃酒中應(yīng)用的結(jié)果。?

本發(fā)明的技術(shù)方案：一種氨基甲酸乙酯EC降解酶產(chǎn)生菌，是從小鼠的腸道中分離得到一株產(chǎn)EC降解酶的菌株，其分類命名為變幻青霉（Penicillium?variabile）JN-A525，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏編號(hào)為：CGMCC?No.5763。?

所述的EC降解酶產(chǎn)生菌，本菌株的擴(kuò)增ITS區(qū)全序列，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1。?

菌株CGMCC?No.5763所產(chǎn)酶的最適pH為4.0-6.0，最適溫度為50℃左右；該酶在40-50℃之間，pH值7-9之間，酶具有較好的穩(wěn)定性。?

本發(fā)明的菌株CGMCC?No.5763是從小鼠的腸道組織及內(nèi)容物中分離獲取。?

菌株的鑒定：?

（1）設(shè)計(jì)特異性引物，引物名稱：ITS1，ITS4

（2）提取基因組DNA。

（3）合成引物，擴(kuò)增ITS區(qū)全序列，擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示。?

（4）PCR產(chǎn)物純化。?

（5）PCR產(chǎn)物測(cè)序。本菌株的擴(kuò)增ITS區(qū)全序列，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1。?

（6）系統(tǒng)發(fā)育樹：如圖6所示。?

將EC分解酶產(chǎn)生菌CGMCC?No.5763的rDNA?ITS序列的測(cè)序結(jié)果通過NCBI網(wǎng)站上的Blast程序與Genbank中核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)和Penicillium?variabile?的rDNA?ITS序列相似性達(dá)97%，同時(shí)EC分解酶產(chǎn)生菌CGMCC?No.5763與Penicillium?variabile?在基于rDNA?ITS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹上處于同一分支，且二者的菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)特征相同，生理生化特征基本一致，因此鑒定該菌株為是青霉屬（Penicillium）中變幻青霉（Penicillium?variabile）JN-A525。?

該菌株在察氏培養(yǎng)基上，菌落質(zhì)地絨狀，致密，平坦，較薄；邊緣菌絲體黃色，略帶綠色；菌落反面呈橙黃色至紅棕色；在電鏡中觀察分生孢子為卵圓形或橢圓形，壁光滑或稍粗糙。?

粗酶液的制備及研究?