[發(fā)明專利]解脲脲原體和微小脲原體的熒光定量檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210124339.3
• 申請日: 2012-04-25
• 公開（公告）號: CN103045721A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙縝;劉璐;平亞芬
• 申請（專利權(quán)）人: 上海國興醫(yī)療器械有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;G01N21/64
• 代理公司: 上海漢聲知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31236
• 代理人: 郭國中

1.一種解脲脲原體和微小脲原體的熒光定量檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

步驟一，樣本處理和DNA提取；

步驟二，將與解脲脲原體的拓撲異構(gòu)酶IV?DNA互補的寡核苷酸序列作為PCR反應(yīng)中的正向引物、反向引物和熒光標記探針加入一個PCR擴增管中；

步驟三，將與微小脲原體的拓撲異構(gòu)酶IV?DNA互補的寡核苷酸序列作為PCR反應(yīng)中的正向引物、反向引物和熒光標記探針加入另一個PCR擴增管中；

步驟四，在相同的擴增條件下，同時分別擴增上述兩個擴增管中所述解脲脲原體和所述微小脲原體的DNA靶序列；

步驟五，檢測所述反應(yīng)體系中不同熒光信號的變化，通過標準曲線來判斷待測樣品中是否含有解脲脲原體、微小脲原體或混合感染，并確定其相應(yīng)含量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光定量檢測方法，其特征在于，在所述步驟一中，所述樣本處理和DNA提取的具體過程包括：將標本管置于振蕩器上振蕩，自管壁擠干棉試子，吸取全部液體轉(zhuǎn)至潔凈的離心管中，12000rpm/min離心10分鐘，去上清，沉淀加入裂解液溶解，37℃保溫60min，沸水浴保溫5min，酚氯仿抽提法抽提DNA，提取的DNA沉淀溶于TE緩沖液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光定量檢測方法，其特征在于，在所述步驟二中，所述正向引物與所述解脲脲原體的拓撲異構(gòu)酶IV基因?qū)?yīng)的靶序列上游位點雜交；所述反向引物與所述解脲脲原體的拓撲異構(gòu)酶IV基因?qū)?yīng)的靶序列下游位點雜交；所述熒光標記探針與所述解脲脲原體的拓撲異構(gòu)酶IV基因?qū)?yīng)靶序列雜交。

4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的熒光定量檢測方法，其特征在于，在所述步驟二中，所述熒光標記探針的序列選自SEQ?ID?No.4所示的序列或其互補序列，或由該序列或其互補序列衍生出的差別不大于3個堿基的核苷酸序列。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光定量檢測方法，其特征在于，在所述步驟三中，所述正向引物與所述微小脲原體的拓撲異構(gòu)酶IV基因?qū)?yīng)的靶序列上游位點雜交；所述反向引物與所述微小脲原體的拓撲異構(gòu)酶IV基因?qū)?yīng)的靶序列下游位點雜交；所述熒光標記探針與所述微小脲原體的拓撲異構(gòu)酶IV基因?qū)?yīng)靶序列雜交。

6.根據(jù)權(quán)利要求1、2或5所述的熒光定量檢測方法，其特征在于，在所述步驟三中，所述熒光標記探針的序列選自SEQ?ID?No.8所示的序列或其互補序列，或由該序列或其互補序列衍生出的差別不大于3個堿基的核苷酸序列。

7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或5所述的熒光定量檢測方法，其特征在于，所述熒光標記探針為TaqMan探針，所述探針5′端標記有熒光報告基團，3′端標記有熒光淬滅基團。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的熒光定量檢測方法，其特征在于，所述熒光報告基團選自FAM、TAT、JOE、ROX、VIC、TAMRA、CY3或CY5。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的熒光定量檢測方法，其特征在于，所述熒光淬滅基團選自TAMRA、DABCYL或NFQ。