[發明專利]一種羊口瘡病毒實時熒光定量PCR檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201210123595.0
• 申請日: 2012-04-25
• 公開（公告）號: CN102676694A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 杜紅延;羅樹紅;郝文波;李明
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 林名欽

1.一種羊口瘡病毒實時熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于包括SEQ?ID?NO:1~2所示核苷酸序列的一對引物和SEQ?ID?NO:3所示核苷酸序列的TaqMan探針，TaqMan探針的5’端標記有熒光報告基因，3’端標記有淬滅熒光基團。

2.根據權利要求1所述羊口瘡病毒實時熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于所述TaqMan探針的5’端標記的熒光報告基因為FAM，3’端標記的淬滅熒光基團為Tamara。

3.根據權利要求1所述羊口瘡病毒實時熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于試劑盒中還包括PCR反應緩沖液、dNTP、DNA聚合酶、陽性質控品和陰性質控品。

4.根據權利要求3所述羊口瘡病毒實時熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于試劑盒組成為：

TaqMan探針引物混合液1管：濃度為5μM的TaqMan探針、濃度為10μM?的SEQ?ID?NO:1所示引物和濃度為10μM?的SEQ?ID?NO:2所示引物按體積比為1:1:1組成的混合液；

TaqMan?Mix?1管：10×PCR反應緩沖液、25mM的dNTP和10U?的DNA聚合酶以及酶稀釋液按體積比為25:4:5:1組成的混合液；

陽性質控品1管：濃度為0.5ng/μL的羊口瘡病毒ORFV024基因片段樣品；

陰性質控品1管：0.01M?PBS；

無菌水1管。

5.根據權利要求3所述羊口瘡病毒實時熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于試劑盒實時熒光定量PCR反應體系為25μL，其中5μM的TaqMan探針1μL，10μM的上、下游引物各1μL，樣品DNA?1μL，10×PCR反應緩沖液2.5μL，25mM的dNTP?0.4?μL，10?U?DNA聚合酶0.5?μL，0.1μL酶稀釋液，無菌水補足到25μL；或按照上述比例配制。

6.權利要求1~5任一所述羊口瘡病毒實時熒光定量PCR檢測試劑盒的使用方法，其特征在于實時熒光定量PCR反應條件為：?95℃?10min；95℃?15s，58℃?45s，共40個循環，在每個循環的延伸結束時進行熒光信號檢測。

7.根據權利要求6所述羊口瘡病毒實時熒光定量PCR檢測試劑盒的使用方法，其特征在于先用不同稀釋度的含羊口瘡病毒ORFV024基因片段樣品作為標準品進行實時熒光定量PCR，以ORFV024基因片段拷貝數為橫坐標，Ct值為縱坐標建立標準曲線，再將待檢樣品的實時熒光定量PCR檢測結果與標準曲線對照，得出檢測結果。

8.根據權利要求7所述羊口瘡病毒實時熒光定量PCR檢測試劑盒的使用方法，其特征在于所述含目的基因片段樣品為含有ORFV024基因片段的質粒；所述ORFV024基因片段是以SEQ?ID?NO:4~5所示核苷酸序列為引物，以羊口瘡病毒基因組DNA為模板擴增得到的。

9.根據權利要求7所述羊口瘡病毒實時熒光定量PCR檢測試劑盒的使用方法，其特征在于稀釋濃度分別為：1.06×10⁸copies/μL；?②1.06×10⁷copies/μL；③1.06×10⁶copies/μL；④1.06×10⁵copies/μL；⑤1.06×10⁴copies/μL；⑥1.06×10³copies/μL；⑦1.06×10²copies/μL；⑧1.06×10¹copies/μL；⑨1.06×10⁰copies/μL。