[發(fā)明專利]尖吻蝮蛇血凝酶基因及其表達載體、宿主細胞和重組蛋白的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210123508.1
• 申請日: 2012-04-25
• 公開（公告）號: CN102660565A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發(fā)明（設計）人: 鄭穎;范泉水;葉鋒平;沈居仁
• 申請（專利權）人: 鄭穎;范泉水
• 主分類號: C12N15/57
• 分類號: C12N15/57;C12N9/64;C12N15/10;C12N15/70;C12N15/81
• 代理公司: 昆明科陽知識產權代理事務所 53111
• 代理人: 孫山明

1.36KDa單鏈尖吻蝮蛇血凝酶基因，其特征是該基因自5’端至3’端由783個核苷酸編碼組成，DNA序列為SEQ?ID?NO：2；該基因編碼的單鏈糖蛋白的成熟蛋白含236個氨基酸殘基，氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1，其中含24個氨基酸殘基的信號肽部分；該基因編碼的單鏈糖蛋白的分子量為36±3?KDa，等電點為6.59。

2.根據權利要求1所述的血凝酶基因，其特征是該基因具有以下特征：

（1）精氨酸酯酶活性

該基因編碼的蛋白（36KDa-HCA）能水解精氨酸甲酯（TAME）和精氨酸乙酯（BAEE），活性分別為158435?U/mg和332518?U/mg；

以TAME為底物測定36KDa-HCA精氨酸酯酶活性，該酶在溫度20℃～50℃和pH?6.0-10.0的條件下較穩(wěn)定；在溫度高于60℃時活性下降，70℃下降40～45%、80℃活性下降45～55%、90℃活性下降50～60%；

在pH2.0、3.0、11.0條件下，活性分別為pH7.4時的40～45%、45～55%和65～75%；

Zn²⁺、Cu²⁺、苯甲基磺酰氟（PMSF）、β-巰基乙醇、抑肽酶和苯甲脒能夠抑制該基因蛋白的精氨酸酯酶活性，其中，Zn²⁺?和PMSF的抑制率分別為35～40%和90～98%；

（2）?纖維蛋白原水解活性

該36KDa-HCA在15min內優(yōu)先降解牛纖維蛋白原的Aα鏈，且水解活性呈劑量與時間依賴性關系。

3.一種克隆如權利要求1所述的36KDa單鏈尖吻蝮蛇血凝酶基因的方法，其特征是：

（1）活體尖吻蝮蛇提取尖吻蝮蛇毒腺總RNA；

（2）?cDNA第一鏈合成（mRNA）反轉錄

在DEPC處理的PCR管中加入以下溶液：

Total RNA0.2~2mgOligo (dT)15 (20mM)1mLdNTP Mixture (10mM each)1mL5×M-Mulv RT Buffer?? 4mLM-Mulv反轉錄酶（200u/mL）?? 1mLRnase Inhibitor (40 u/mL)?? 0.5mLRnase Free H₂OUp to 20 mL

PCR反轉錄反應條件：30℃?5min，42℃?30~40min，95℃?5min，產物4℃保存；

（3）?PCR擴增類凝血酶基因

以反轉錄cDNA產物作為擴增尖吻蝮蛇類凝血酶基因序列的模板，引物如下：

TLE-ZQ（?SEQ?ID?NO：3）

5'-GCAGAGTTGAAGCTATGGT-3'；

TLE-P4?（SEQ?ID?NO：4）

5'-AAGGCAGTCCTATTTGAGTCTAA-3'；

采用Ex?Taq?PCR聚合酶進行擴增，PCR擴增條件：94℃3?min;?94℃?0.5min,?60℃?0.5min，72℃?4min或2min，35個循環(huán)，72℃延伸10min；

（4）篩選36KDa-HCA基因克隆

使用引物F1?（SEQ?ID?NO：5）：5'-GGAGGTAATGAATGTGACAC-3'和R1（SEQ?ID?NO：6）：5'-GAGTCTAAAAAAAGCTTACTG-3'進行菌落PCR，篩選血凝酶36KDa-HCA基因克??；

PCR條件94℃3?min;?94℃?0.5min,?60℃?0.5min，72℃?4min或2min，35個循環(huán)，72℃延伸10min。