[發明專利]抗鹽酸克倫特羅抗體及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 201210122529.1
• 申請日: 2012-04-24
• 公開（公告）號: CN102659949A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發明（設計）人: 鄭曙劍;殷秀飛;陳國琴
• 申請（專利權）人: 杭州隆基生物技術有限公司
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;G01N33/558
• 代理公司: 浙江永鼎律師事務所 33233
• 代理人: 王梨華;陳麗霞

技術領域

本發明屬于免疫檢測技術領域，具體涉及抗鹽酸克倫特羅抗體、以鹽酸克倫特羅-牛血清白蛋白為免疫原制備抗鹽酸克倫特羅抗體的方法和將抗鹽酸克倫特羅抗體應用于鹽酸克倫特羅快速檢測試劑。

背景技術

鹽酸克倫特羅是一種β一受體激動劑，臨床適應證用于哮喘、支氣管哮喘、慢塞性肺病、肺炎等疾病。鹽酸克倫特羅用于飼料添加劑，具有降低脂肪含量，提高瘦肉率的作用，它潛在的危害就逐漸被人們所認識。雖然鹽酸克倫特羅L具有促進動物生長，提高飼料利用率，改善瘦肉率的作用。但該藥排泄速率慢，易蓄積在動物組織中，引起消費者發生急性中毒。當人食入有鹽酸克倫特羅殘留的內臟組織如肝、腎、肺時可能會出現β一受體激動劑的毒副作用。人、畜中毒癥狀主要有骨骼肌收縮增加，肌肉震顫，四肢和面部肌肉最明顯，輕者感覺不適，嚴重者還可危及生命，因此，鹽酸克倫特羅快速檢測試劑的開發對動物性食品檢測以及人類健康具有重要意義。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種抗鹽酸克倫特羅抗體。

本發明的第二個目的是提供以鹽酸克倫特羅-牛血清白蛋白為免疫原制備得到抗鹽酸克倫特羅抗體的過程。

本發明的第三個目的是提供一種鹽酸克倫特羅快速檢測試劑，是抗鹽酸克倫特羅抗體的有效應用。

本發明所述的抗鹽酸克倫特羅抗體的制備方法為：用鹽酸克倫特羅人工免疫抗原免疫小鼠，取小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞融合，由間接ELISA和間接競爭ELISA兩種方法結合篩選出對鹽酸克倫特羅有特異性的雜交瘤細胞，從注射雜交瘤細胞的動物腹水中，分離獲得所述抗鹽酸克倫特羅抗體。

所述鹽酸克倫特羅人工免疫抗原為鹽酸克倫特羅-牛血清白蛋白偶聯物(clen-BSA)，是按以下方法自制得到：

A.采用重氮偶合反應，鹽酸克倫特羅分子上的氨基在亞硝酸鈉與鹽酸的作用下形成重氮鹽，此重氮鹽在堿性條件下與牛血清白蛋白(BSA)上的酚羥基反應，形成以偶氮鍵相聯的結合物免疫原。

B.將合成產物置入pH值為7.4、濃度為10mM(mM為“毫摩爾”，表示濃度)磷酸鹽緩沖液4℃攪拌透析2天，每天換液2次，以去除未結合的鹽酸克倫特羅或其它小分子物質，透析后-20℃密閉保存。

篩選抗體用鹽酸克倫特羅-卵清蛋白偶聯物同上述方法一樣合成。

本發明提供的抗鹽酸克倫特羅抗體可應用于檢測鹽酸克倫特羅殘留。

本發明還提供一種鹽酸克倫特羅快速檢測試劑。其制備方法為：利用膠體金免疫層析的原理，在硝酸纖維素膜上的檢測區包被clen-BSA，對照區包被羊抗鼠多克隆抗體。當待測物中有被測的抗原物質(即鹽酸克倫特羅)時，待測物中的抗原物質就會與標記膠體金的抗克倫特羅抗體形成Ag-Ab-Au復合物，該復合物中抗體的活性位點將因被樣品溶液中的藥物占據而無法與T線上藥物抗原結合；所以當樣品中的鹽酸克倫特羅含量達3μg/L以上時，檢測卡上的T線不顯色，可以判定為陽性。反之，當樣品中鹽酸克倫特羅含量在3μg/L以下或無殘留時，檢測卡上的T線顯色，判定為陰性。

目前對鹽酸克倫特羅殘留檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣-質聯用法(GC/MS)、放射免疫分析法(RIA)、氣相色譜法(GC)、高效薄層色譜法(HPTLC)、液-質聯用分析法(LC/MS)、酶聯免疫吸附測定法(ELISA)等。由于各種檢測方法的不同(包括方法學原理，使用的生物制劑的質量，操作人員的素質及使用設備的好壞等)，所得結果并不能說明某種檢測方法的優劣。這些方法準確，靈敏度較高，出現假陽性、假陰性的機率較低，其中RIA、ELISA、TLC等方法可以大批量檢測，樣品不需要經過處理，但需要特定的設備，操作人員需要技術培訓；GC/MS、HPLC等方法的設備更加昂貴，操作人員技術要求更高，且檢測量少。上述檢測方法都要求在實驗室中通過儀器完成，幾個小時之后才能給出鑒定結果，不適合現場初篩。鹽酸克倫特羅快速檢測試劑具有攜帶方便，不需要設備，操作人員無需技術培訓，可現場操作，3～5分鐘即可給出結果等優點，非常適合對大批量樣本進行現場篩查的工作。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步詳細描述。

實施例1

抗鹽酸克倫特羅抗體的制備方法為以下順序步驟：

1.免疫動物：